Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. TỔNG QUAN VỀ GEN AIP
1.4.1. Đặc điểm gen AIP
Gen AIP nằm trên vai dài nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2), gen có 6 exon mã
hóa protein AIP có 330 amino acid, trọng lƣợng phân tử là 37kDa [144].
Hình 1.6. Sơ đồ vị trí và cấu trúc gen AIP [143]
(A) Vị trí gen AIP trên nhiễm sắc thể số 11 (nguồn http://www.genecards.org/) - vị trí
mũi tên đỏ. (B) Sơ đồ gen AIP. Các hộp xanh có ghi số biểu thị các exon. (C) Các vùng chức năng protein AIP tương ứng với các exon mã hóa. Vùng PPIase (peptidyl-prolyl cis-transisomerase). Các vùng TPR (tetratricopeptide repeat). Vùng xoắn α. Các chữ số biểu thị số amino acid tại các vùng chức năng protein.
Protein AIP thuộc họ protein TPR (Tetratricopeptide repeat). AIP cịn có các tên gọi khác là XAP2 (X-Associated Protein-2); ARA9 (Aryl hydrocarbon Receptor Activated 9) hay FKBP37 (FK506-Binding Protein 37). Các vùng cấu trúc của protein AIP bao gồm: vùng giống PPIase (Peptidyl-prolyl cis-transisomerase-like) nằm ở đầu N. Phía đầu C có 3 vùng TPR gồm TPR1, TPR2 và TPR3, mỗi vùng TPR có 34 amino acid, phân bố thành những trình tự lặp lại liên tiếp, cấu trúc thành 2 xoắn α đối song song (antiparalell alpha helixes). Cuối cùng là chuỗi xoắn α-7
Protein AIP phân bố rộng rãi ở các mô trong cơ thể ngƣời, tuy nhiên mức biểu hiện AIP khác nhau đáng kể giữa các mơ, có nhiều nhất ở hệ tim mạch, não, cơ hồnh, thận và tinh hồn [15]. AIP có đặc tính bảo thủ cao giữa các lồi trong q trình tiến hóa. Ví dụ protein AIP của ngƣời có tỷ lệ tƣơng đồng là 100, 94 và 93% tƣơng ứng với các loài tinh tinh, chuột nhắt (mouse) và chuột cống (rat) [73, 181]. Tính chất bảo thủ của protein AIP đƣợc cho là xuất phát từ hai lý do. Thứ nhất: AIP có liên quan đến bệnh ở ngƣời và một số nghiên cứu phát hiện ra rằng các gen gây bệnh ở ngƣời bảo thủ hơn các gen không gây bệnh [113]. Thứ hai: AIP đƣợc chứng minh cần thiết cho sự phát triển của tim đồng thời duy trì tạo hồng cầu ở chuột [86, 106] và cùng với các nghiên cứu trƣớc đây ở động vật có vú cũng nhƣ các sinh vật nhân chuẩn khác cho thấy, các gen thiết yếu cho sự phát triển của cơ thể động vật thƣờng nằm trong vùng bảo thủ của hệ gen [113].
Hình 1.7. Cấu trúc protein AIP [178]
Vùng PPIase (Peptidyl-prolyl cis-transisomerase) nằm phía đầu cuối N (N-terminal) của protein. Các vùng TPR (Tetratricopeptide repeat) phân bố ở vùng đầu cuối C (C- terminal) gồm TPR1, TPR2 và TPR3. Mỗi vùng TPR cấu trúc thành hai xoắn α đối song song (antiparalell alpha helixes). Cuối cùng là xoắn α-7.
1.4.2. Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ở ngƣời
AIP tƣơng tác với nhiều protein khác nhau trong tế bào, có 20 tƣơng tác protein của AIP đƣợc mơ tả cho đến nay, trong đó 14 protein là liên kết trực tiếp với AIP, ba liên kết chƣa đƣợc xác thực và ba liên kết là qua trung gian protein khác
(Hình 1.8) [181].
Hình 1.8. Sơ đồ mạng lƣới tƣơng tác của protein AIP [181]
Các chấm trịn trên hình tương ứng các protein tương tác với protein AIP, màu của chấm phân biệt các nhóm protein khác nhau. Đường kẻ liền biểu thị tương tác đã được xác nhận. Đường kẻ đứt quãng biểu thị tương tác chưa được xác nhận.
Thông qua các protein tƣơng tác, các thể đột biến AIP có phạm vi ảnh hƣởng rộng đến các chức năng khác nhau trong tế bào [181]. Nghiên cứu sự phát triển của chuột cho thấy, chuột thiếu protein AIP dẫn đến các vấn đề về tim mạch, chết phôi. Rối loạn biểu hiện AIP cũng gây các bất thƣờng ở ngƣời. Các thể đột biến gen AIP mất khả năng ức chế phân bào và khơng có khả năng liên kết với các protein thành phần [79]. AIP hoạt động nhƣ là nhân tố áp chế khối u ở hầu hết các mô [73, 83,
186]. Sự biểu hiện gen AIP ở ngƣời đƣợc chứng minh là làm giảm tăng sinh các tế bào nguyên bào sợi và các thể đột biến AIP thì mất khả năng ngăn chặn tăng sinh tế bào [71, 102]. Đột biến gen AIP liên quan tới bệnh u tuyến yên đã đƣợc nhiều
nghiên cứu chứng minh [73, 138, 179]. Có khoảng 70 đột biến khác nhau trên gen
AIP đƣợc xác định ở những ngƣời bị u tuyến yên, các loại đột biến bao gồm: sai
nghĩa, vô nghĩa, dịch khung, đột biến vùng promoter, đột biến vị trí ghép nối exon [15, 73]. Khoảng một phần tƣ các trƣờng hợp u tuyến n mang tính gia đình là có đột biến gen AIP ở tế bào mầm [73, 186]. Đột biến bất hoạt gen AIP thấy ở 40% các trƣờng hợp u tuyến yên loại tiết hormon sinh trƣởng. Những đột biến này cũng thấy ở 13% trƣờng hợp u tuyến thể to (macroadenomas) dƣới 30 tuổi [28, 36, 59]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra ở những ngƣời bị u tuyến yên mà mang đột biến gen AIP thì có thời gian khởi phát bệnh sớm, bệnh biểu hiện trầm trọng, không đáp ứng tốt với điều trị và cần phải can thiệp phẫu thuật, so với những trƣờng hợp khơng có đột biến gen AIP [73, 102]. Nghiên cứu ở ngƣời cho thấy sự giảm biểu hiện gen AIP có liên quan tới u tuyến giáp, tu tuyến thƣợng thận [138]. Nghiên cứu đột biến gen AIP cũng đƣợc tiến hành trên các đối tƣợng ung thƣ vú, đại tràng và tuyến tiền liệt nhƣng không phát hiện thấy có đột biến [64].
1.5. VAI TRỊ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƢỜNG TÍN HIỆU THƠNG QUA THỤ THỂ AhR
Protein AIP đƣợc chứng minh đóng vai trị quan trọng trong phát triển sinh lý của cơ thể và con đƣờng chuyển hóa phụ thuộc AhR [79, 137]. AIP là một thành viên của phức hệ AhR trong bào tƣơng, AIP liên kết trực tiếp với thụ thể AhR và protein HSP90. AIP có các vai trị làm ổn định phức hợp của AhR gắn kết với phối tử (ligand), duy trì AhR trong bào tƣơng và ngăn chặn sự phân giải AhR bởi proteasome [144, 152]. Sự thay đổi một amino acid tại vùng chức năng chính trên protein AIP có thể ảnh hƣởng đến tính nguyên vẹn của thụ thể AhR hoặc sự truyền tín hiệu của thụ thể AhR [83, 162].
AIP không chỉ liên kết với các protein trong phức hệ của AhR mà còn điều hòa hoạt động phiên mã của gen AhR. Vai trò của protein AIP trong điều hòa hoạt
động của gen AhR vẫn còn mẫu thuẫn giữa các kết quả nghiên cứu. Một số nghiên cứu cho thấy AIP có vai trị thúc đẩy hoạt động phiên mã của gen AhR [27, 98, 128], trong khi các nghiên cứu khác lại chỉ ra AIP ức chế hoạt động của gen AhR [19, 139, 151]. Nguyên nhân của sai khác giữa các kết quả nghiên cứu có thể là do sự khác biệt về loài, ảnh hƣởng đặc hiệu mô và sự có mặt hay vắng mặt của phối tử [15]. Thiếu hoặc giảm hàm lƣợng AIP có tƣơng quan với sự giảm lƣợng AhR [83]. Chuột đột biến mất gen AIP có đặc tính là giảm tới 60% biểu hiện gen AhR và làm thay đổi trong điều hòa biểu hiện các gen đích, nhƣ tăng biểu hiện các gen CYP1A1, CYP1A2 đồng thời giảm biểu hiện gen CYP1B1. Điều này chứng tỏ tầm quan trọng
của tƣơng tác giữa AIP và AhR đối với điều hịa biểu hiện một số gen đích của AhR [137]. Sự nhạy cảm của tế bào với dioxin có liên quan tới protein AIP [162]. Nghiên cứu trên chuột xử lý dioxin cho thấy sự giảm hàm lƣợng protein AIP, dẫn đến loại trừ hoặc giảm nhiễm độc gan do dioxin. Điều đó cũng cho thấy protein AIP đóng vai trị quan trọng trong nhiễm độc dioxin qua trung gian AhR. Nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện của protein AIP trong tế bào gan là cần thiết để duy trì mức độ cao chức năng protein AhR trong tế bào gan ở động vật có vú và sự biểu hiện của protein AIP là cơ sở đối nhiễm độc gan do dioxin [137, 162]. AIP cịn có vai trị đối với hoạt động của các protein thành phần trong con đƣờng tín hiệu AhR. Mặc dù khi phức hệ AhR vào trong nhân tế bào, AIP không liên kết với protein ARNT nhƣng kết quả của các nghiên cứu chỉ ra sự biểu hiện của ARNT giảm đáng kể ở các khối u tuyến yên mang đột biến AIP, điều này cho thấy đột biến mất chức năng AIP dẫn đến mất cân bằng trong tạo phức hệ AhR - ARNT ở nhân tế bào và dẫn đến bất thƣờng trong điều hòa biểu hiện các gen đích của con đƣờng tín hiệu AhR [71, 158]. Protein AIP có vai trị kiểm sốt sự ổn định và vị trí của phức hệ liên kết AIP - AhR - HSP90 trong bào chất [181]. Một trong những nhân tố kiểm soát hoạt động của thụ thể AhR là protein AhRR (AhRR - Aryl hydrocarbon Receptor Repressor), trong khi đó sự tăng biểu hiện của AhRR gây ra bởi dioxin lại địi hỏi phải có protein AIP [137]. Ngồi tƣơng tác với thụ thể AhR, AIP còn liên kết với phosphodiesterase - là enzyme xúc tác quá trình thủy phân AMP vịng
(cAMP - Cyclic Adenosine Monophosphate). cAMP là nhân tố quan trọng của con đƣờng truyền tín hiệu nội bào, qua đó cho thấy AIP cũng ảnh hƣởng đến con đƣờng tín hiệu cAMP [73, 162].
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN CÁC NẠN NHÂN PHƠI NHIỄM DIOXIN Ở VIỆT NAM DIOXIN Ở VIỆT NAM
Tại Việt Nam, đã có các nghiên cứu đánh giá sự thay đổi nội tiết, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lƣu dioxin trong máu, trong sữa mẹ ở những ngƣời dân sống trong vùng ô nhiễm chất da cam/dioxin. Cùng với đó là các nghiên cứu điều tra thực trạng, cơ cấu bệnh tật trên đối tƣợng nạn nhân dioxin [3, 6, 8, 9]. Các nghiên cứu này đa phần là điều tra dịch tễ và thăm khám lâm sàng, so sánh bệnh chứng giữa nhóm phơi nhiễm và khơng phơi nhiễm dioxin. Những kết quả nghiên cứu đã đóng góp vào các chƣơng trình đánh giá tác hại của chất da cam/dioxin đối với con ngƣời và môi trƣờng Việt Nam, khắc phục hậu quả của chất độc da cam/dioxin sau chiến tranh, xây dựng chính sách giúp đỡ các gia đình nạn nhân dioxin; có ý nghĩa trong việc khoanh vùng, tẩy độc và phục hồi môi trƣờng bị ô nhiễm dioxin.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử và công nghệ gen, ảnh hƣởng của dioxin trên ngƣời ở mức độ phân tử cũng đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Các nghiên cứu đã đánh giá những thay đổi trong biểu hiện và cấu trúc ở một số gen liên quan đến dioxin. Gần đây (năm 2015), tác giả Nông Văn Hải và cs đã tiến hành đề tài nghiên cứu biến đổi gen, nhiễm sắc thể ở một số gia đình nạn nhân chất da cam/dioxin. Kết quả các nghiên cứu đã chỉ ra những thay đổi trong biểu hiện/đột biến ở các gen nhƣ: p53, CypP1A1, AhR, CypP1B1, hOGG1, GSTM1, GSTT1,
MSH2 trên đối tƣợng phơi nhiễm dioxin [1, 4, 180]. Đối với gen AhR - gen mã hóa
thụ thể của dioxin, chƣa có nhiều nghiên cứu tập trung xác định đa hình/đột biến trên toàn bộ vùng biểu hiện gen AhR. Với gen AIP - gen đóng vai trị quan trọng
trong con đƣờng chuyển hóa dioxin thơng qua thụ thể AhR, cho đến nay chƣa có nghiên cứu về biến đổi gen AIP ở ngƣời nhiễm dioxin nói riêng và quần thể ngƣời Việt Nam nói chung.
Dioxin gây ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời, không chỉ đối nạn nhân nhiễm dioxin mà cả với các con cái của họ. Dioxin đƣợc chứng minh là tác nhân gây ung thƣ. Các rối loạn bệnh lý do dioxin gây ra rất đa dạng, ở nhiều cơ quan khác nhau trong cơ thể. Trong cơ chế phân tử tác động của dioxin có sự tham gia của nhiều gen đóng vai trị quan trọng trong cơ thể, dữ liệu về các gen tham gia cũng nhƣ ảnh hƣởng đa hình/đột biến của các gen này liên quan đến cơ thế tác động của dioxin vẫn còn nhiều điều chƣa đƣợc biết đến. Mặt khác, dioxin gây tổn thƣơng vật chất di truyền và phát sinh đột biến gen. Các gen bị tổn thƣơng bởi dioxin cũng nhƣ ảnh hƣởng của những thay đổi trong gen dẫn đến các bệnh lý của ngƣời vẫn là vấn đề rất phức tạp và chƣa đƣợc biết rõ. Do vậy cần có những nghiên cứu ở sâu hơn ở mức độ hệ gen trên đối tƣợng nạn nhân dioxin.
Giải trình tự tồn bộ hệ gen (WGS - Whole Genome Sequencing) và giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES - Whole Exome Sequencing) là những ứng dụng của cơng nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS - Next Generation Sequencing), cho phép tìm kiếm và xác định các biến thể di truyền có trong cá thể [66]. Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) trên các đối tƣợng nạn nhân dioxin đã đƣợc tiển khai nghiên cứu gần đây tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đề tài cấp Nhà nƣớc thuộc chƣơng trình 33 (KHCN - 33/11 - 15) do TS. Nguyễn Đăng Tơn làm chủ nhiệm, theo mơ hình nghiên cứu trio (bố - con - mẹ) đã giải mã hệ gen (genome) một số gia đình nạn nhân chất độc da cam/dioxin.
Giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES) nhằm xác định các biến thể di truyền trên tất cả các vùng mã hóa (exome) trong hệ gen [189]. Trong hệ gen của ngƣời, vùng gen mã hóa chiếm khoảng 1% tồn bộ hệ gen. Ngƣời ta ƣớc tính 85% các đột biến gây bệnh nằm trong các vùng mã hóa của hệ gen [115]. Giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES) đã đƣợc áp dụng trong chẩn đoán các bệnh di truyền đơn gen hiếm gặp, bệnh khó chẩn đốn, các hội chứng đa gen (polygenic disorder), các bệnh phức hợp (complex disease) [67, 156]. Công nghệ WES cũng đã đƣợc chứng minh thành cơng đáng kể trong tìm ra các đột biến mới (de novo mutation) - đột biến ở con nhƣng khơng có ở bố mẹ; phát hiện đột biến gen gây nên
các rối loạn kiểu hình giống nhau, cũng nhƣ xác định biến thể di truyền gây ra các bệnh thông thƣờng và ung thƣ, trong đó có các bệnh trong danh mục bệnh, tật do dioxin gây ra. Ví dụ nhƣ: ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ phổi, đái tháo đƣờng type 2, thiểu năng trí tuệ, u lympho, tự kỷ, dị dạng não [18, 115, 156, 189]. Ở Việt Nam, trên đối tƣợng nạn nhân dioxin, tác giả Nông Văn Hải và cs đã tiến hành đề tài NAFOSTED (106-YS.01-2014.34) giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (exome) ở một số con/cháu của các nạn nhân chất độc da cam/dioxin bị thiểu năng trí tuệ. Cơng nghệ giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES) ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu cũng nhƣ áp dụng vào chẩn đoán lâm sàng các bệnh di truyền ở ngƣời.
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Lựa chọn đối tƣợng nghiên cứu Lựa chọn đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là 94 ngƣời phơi nhiễm dioxin đã đƣợc xét nghiệm dioxin trong huyết thanh máu và 20 ngƣời không phơi nhiễm dioxin (sống ở khu vực quận Hà Đông, Hà Nội, nơi không bị phun rải chất độc da cam/dioxin).
Đối tƣợng phơi nhiễm dioxin trong nghiên cứu này thuộc đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu sự biến động sức khỏe, bệnh tật và nồng độ dioxin ở ngƣời có nồng độ dioxin cao, đề xuất các giải pháp và điều trị”, mã số KHCN-33.04/11-15. Tiêu chuẩn chọn đối tƣợng: ngƣời có tiền sử phơi nhiễm rõ ràng với chất độc da cam/dioxin; ngƣời dân sống tại điểm nóng chất độc da cam/dioxin (khu vực sân bay Biên Hòa và sân bay Đà Nẵng) với thời gian trên 05 năm. Các đối tƣợng phơi nhiễm đƣợc khám lâm sàng, làm các xét nghiệm xác định bệnh liên quan đến dioxin (thuộc danh mục 17 bệnh, tật, dị dạng, dị tật có liên quan đến phơi nhiễm dioxin - phụ lục). Xét nghiệm dioxin trong huyết thanh máu tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Y dƣợc học quân sự, Học viện Quân y và Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga.
Đối tƣợng nhiễm dioxin đƣợc nghiên cứu giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES) thuộc đề tài NAFOSTED “Giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (exome) ở một số con/cháu các nạn nhân chất độc da cam/dioxin bị thiểu năng trí tuệ”, mã số 106-YS.01-2014.34. Đối tƣợng là một cựu chiến binh, sinh năm 1930, đã tham gia chiến đấu từ năm 1970 đến 1972 tại chiến trƣờng Quảng Trị, nơi Quân đội Mỹ phun rải chất độc da cam. Đối tƣợng đƣợc xác định có nồng độ dioxin trong máu cao (19,65 ppt). Đối tƣợng có một con gái bị thiểu năng trí tuệ, dị tật bẩm sinh.
Cỡ mẫu nghiên cứu
Số mẫu phơi nhiễm dioxin trong nghiên cứu đƣợc xác định theo cơng thức tính cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang nhƣ sau:
⁄
Với mức ý nghĩa thống kê α = 0,05, hệ số tin cậy Z (1-α/2)= 1,96. Khoảng sai