Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.6. Giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES)
2.3.6.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu máu toàn phần của đối tƣợng nghiên cứu đƣợc tách chiết DNA tổng số bằng kit QIAamp DNA Blood Midi Kit của hãng QIAGEN, tiến hành theo qui trình của nhà sản xuất. Sản phẩm DNA tổng số đƣợc kiểm tra đánh giá bằng kit Qubit® dsDNA HS Assay, sử dụng thiết bị định lƣợng acid nucleic Qubit® 2.0
2.3.6.2. Thiết lập thư viện DNA
Chúng tôi sử dụng kit SureSelect Target Enrichment system for illumina paired - end multiplex sequencing để thiết lập thƣ viện DNA cho giải trình tự tồn bộ exome. Các bƣớc chính nhƣ sau:
Bƣớc 1: Phân cắt DNA. Khoảng 3 µg DNA tổng số đƣợc phân cắt thành các đoạn có kích thƣớc 150 - 200 bp theo các điều kiện của máy CovarisE210.
Bƣớc 2: Tinh sạch DNA bằng hạt từ AMPure XP Bead. Để hạt từ AMPure XP Bead ở nhiệt độ phịng ít nhất 30 phút, trộn đều để các hạt từ phân tán đồng nhất
trong dung dịch. Thêm 180 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất vào các giếng chứa DNA đã cắt và trộn đều. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 phút. Đặt khay chứa mẫu lên giá từ đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Loại bỏ dịch nổi phía trên. Rửa các hạt từ 2 lần bằng 500 µl ethanol, mỗi lần 1 phút. Làm khô các hạt từ bằng cách đặt khay mẫu vào máy luân nhiệt. Cài đặt nhiệt độ 37 oC trong 5 phút. Thêm 50 µl nƣớc không chứa nuclease vào mỗi giếng, trộn đều. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Đặt khay mẫu trở lại giá từ và chờ đến khi dung dịch trong suốt (khoảng 5 phút), sau đó chuyển dịch nổi chứa DNA sang khay đựng mẫu mới.
Bƣớc 3: Làm bằng 2 đầu các đoạn DNA thu đƣợc. Sử dụng bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit. Thành phần phản ứng nhƣ sau:
Hóa chất
Mẫu DNA đã đƣợc phân cắt 10X End Repair Buffer dNTP mix
Nƣớc (không chứa nuclease) T4 DNA Polymerase
Klenow DNA Polymerase T4 Polynucleotide Kinase Tổng thể tích Thể tích (µl) ~50 10 1,6 33,2 1 2 2,2 100
Ủ hỗn hợp phản ứng trong 30 phút ở 20 oC trong máy luân nhiệt. Tinh sạch sản phầm DNA (tƣơng tự bƣớc 2, sử dụng 32 l nƣớc không nuclease).
Bƣớc 4: Gắn Adenine vào đầu các đoạn DNA. Sử dụng kit SureSelectXT Human All Exon Kit cho bƣớc này. Thành phần phản ứng nhƣ sau:
Hóa chất
Mẫu DNA thu đƣợc ở bƣớc 3 10X Klenow Polymerase Buffer Nƣớc (không chứa nuclease) dATP Exo(-) Klenow Tổng thể tích Thể tích (µl) ~32 5 9 1 3 50
Ủ hỗn hợp phản ứng trong máy luân nhiệt ở 37 oC trong 30 phút. Tiến hành tinh sạch sản phẩm DNA thu đƣợc (cách làm tƣơng tự nhƣ bƣớc 2, điểm khác là sử dụng 90 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hòa tan DNA bằng 28,5 l nƣớc không chứa nuclease).
Bƣớc 5: Gắn adaptor. Sử dụng bộ kít SureSelectXT Human All Exon Kit.Thành phần hỗn hợp gắn adaptor nhƣ sau:
Hóa chất
Mẫu DNA thu đƣợc ở bƣớc 4 5X T4 DNA ligase buffer SureSelect Adaptor Oligo Mix T4 DNA ligase Tổng thể tích Thể tích (µl) ~28,5 10 10 1,5 50 Ủ hỗn hợp phản ứng trong máy luân nhiệt ở 20 o
C trong 15 phút. Tinh sạch sản phẩm DNA thu đƣợc (làm tƣơng tự nhƣ bƣớc 2, chỉ khác là sử dụng 90 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hịa tan DNA bằng 32 l nƣớc khơng chứa nuclease).
Bƣớc 6: Khuếch đại phân đoạn DNA gắn adaptor theo SelectXT Human All Exon Kit và Herculase II Fusion DNA polymerase. Thành phần nhƣ sau
Hóa chất
Mẫu thƣ viện DNA đã tinh sạch Nƣớc (không chứa nuclease) SureSelect primer
SureSelect ILM indexing pre capture PCR reverse primer Đệm 5X Herculase II
Hỗn hợp dNTP 100mM
Herculase II Fusion DNA Polymerase Tổng thể tích Thể tích (µl) 15 21 1,25 1,25 10 0,5 1 50 Chu trình nhiệt phản ứng: 980C/2’ [980C/30’’, 650C/30’’, 720C/1’]6 720C/10’. Tinh sạch sản phẩm phản ứng: cách làm tƣơng tự nhƣ bƣớc 2 (sử dụng 90 µl dung
dịch hạt từ đã đồng nhất và hòa tan DNA bằng 30 l nƣớc không chứa nuclease). Đánh giá chất lƣợng và nồng độ của thƣ viện DNA: sử dụng DNA 1000 LabChip trên máy 2100 Bioanalyzer theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.6.3. Làm giàu thư viện DNA
Chuẩn bị dung dịch đệm lai cho mỗi mẫu bằng các hóa chất của bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit, thành phần nhƣ sau:
Hóa chất SureSelect Hyb #1 SureSelect Hyb #2 SureSelect Hyb #3 SureSelect Hyb #4 Tổng thể tích Thể tích (µl) 25 1 10 13 49
Chuẩn bị dung dịch Block Mix bằng các hóa chất của bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit. Thành phần cho mỗi mẫu nhƣ sau:
Hóa chất
SureSelect Indexing Block #1 SureSelect Block #2
SureSelect Indexing Block #3 Tổng thể tích Thể tích (µl) 2.5 2.5 0.6 5.6
Pha lỗng dung dịch SureSelect Rnase Block với nƣớc (khơng chứa nuclease) theo tỷ lệ 1:2. Chuẩn bị dung dịch Capture Library Mix theo bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit, các hóa chất đƣợc giữ trên đá trong quá trình tiến hành. Thành phần cho mỗi mẫu nhƣ sau:
Hóa chất
SureSelect Human All Exon 50M Library SureSelect RNase Block
Tổng thể tích
Thể tích (µl)
5 2 7
Trộn 3,4 µl mẫu dung dịch thƣ viện DNA đã tinh sạch với 5,6 µl Block Mix. Tra hỗn hợp vào giếng ở hàng B của đĩa PCR - 96 giếng. Biến tính hỗn hợp ở 950C trong 5’, sau đó giữ ở 650
C.
Thêm 40 µl dung dịch đệm lai vào các giếng tƣơng ứng trong cùng một cột ở hàng A và ủ ở 650C trong 5 phút. Tƣơng ứng với các giếng trong cùng một cột ở hàng C, thêm 7 µl dung dịch Capture Library Mix và tiếp tục ủ ở 650C trong 2 phút.
Hút 13 µl dung dịch đệm lai từ hàng A chuyển vào cột tƣơng ứng ở hàng C. Hút dung dịch trong các giếng ở hàng B chuyển vào các cột tƣơng ứng ở hàng C. Dùng pipette đảo trộn đều 10 lần. Ủ trong máy luân nhiệt ở 650C trong 24h với nắp đậy cài đặt 1050C.
Tiến hành lai gắn DNA với hạt từ Dynabead thực hiện các bƣớc theo MyOne Streptavidin T1, sau đó tinh sạch mẫu làm tƣơng tự bƣớc 2 (sử dụng 180 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hòa tan DNA bằng 30 l nƣớc không chứa nuclease).
Thành phần phản ứng khuếch đại thƣ viện DNA chuẩn bị theo SelectXT Human All Exon Kit và Herculase II Fusion DNA polymerase. Thành phần của phản ứng nhƣ sau:
Hóa chất Thể tích (µl)
Mẫu thƣ viện DNA gắn hạt từ đã tinh sạch Nƣớc (không chứa nuclease)
PCR primer (Index 1-Index 16)
SureSelect ILM indexing post-capture forward PCR primer Dung dịch đệm 5X Herculase II
Hỗn hợp dNTP 100mM
Herculase II Fusion DNA Polymerase
14 22,5 1 1 10 0,5 1 Tổng thể tích 50 Chu trình nhiệt phản ứng: 980C/2’ [980C/30’’, 570C/30’, 720C/1’]12 720C/10’. Tinh sạch thƣ viện đã đƣợc khuếch đại tƣơng tự nhƣ bƣớc 2 (sử dụng 90 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hòa tan DNA bằng 30 l đệm EB của hãng QIAGEN).
2.3.6.4. Đánh giá thư viện DNA sau khi làm giàu
Thƣ viện DNA đƣợc định lƣợng bằng cách sử dụng kit Qubit Fluorometer BR (Broad range) DNA theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Điện di 1 µl thƣ viện đã đƣợc làm giàu bằng máy Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer, sử dụng chip High Sensitivity DNA. Kì vọng sự phân bố của các đoạn DNA có kích thƣớc từ 200 - 400 bp.
2.3.6.5. Giải trình tự bằng máy Illumina Nextseq-500
Các bƣớc giải trình tự trên máy Illumina đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Dữ liệu thu đƣợc từ máy giải trình tự gen đƣợc định dạng dƣới dạng file fastq. Dữ liệu đƣợc phân tích tin sinh học để xác định các biến thể di truyền, chú giải và sàng lọc các biến thể di truyền.