Bảng 3 .2 Các bệnh liên quan dioxin có trong nhóm 1
Bảng 3.6 Các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu
Số hiệu đa hình Vị trí Thay đổi nucleotide Thay đổi protein Nhóm đối tƣợng PN % (n) Khơng PN % (n) Tổng số mẫu (n) rs17779352 Exon 2 c.132T>C p.N44= 8,3 (1/12) 0 22 rs3802082 Intron 5 c.575-199A>T _ 75 (9/12) 60 (6/10) 22 rs2066853 Exon 10 c.1661G>A p.R554K 63,8 (60/94) 65 (13/20) 114 rs75519181 Exon 10 c.1459A>G p.N487D 2,1 (2/94) 0 114 rs779531731 Exon 10 c.1541T>C p.I514T 1,1 (1/94) 0 114
Chú thích: PN - phơi nhiễm. Khơng PN - khơng phơi nhiễm. Ký hiệu gạch ngang (-) biểu thị đa hình khơng làm thay đổi protein.
Chúng tơi phân tích so sánh tần suất các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu này với tần suất các đa hình gen AhR tƣơng ứng có ở một số quần thể ngƣời trên thế giới, theo cơ sở dữ liệu biến thể di truyền ngƣời (HGVD - Human Genetic Variation Database) với n = 100 cho mỗi quần thể (Bảng 3.7). Trong đó, tần suất các đa hình gen AhR ở ngƣời Việt Nam dựa trên số liệu nghiên cứu quần thể ngƣời Kinh sống ở thành phố Hồ Chí Minh.
Bảng 3.7. So sánh tần suất các đa hình gen AhR trong nghiên cứu, tƣơng ứng với đa hình ở các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD)
Số hiệu đa hình
Trong nghiên cứu % (n)
Tần suất đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể
Việt Nam Nhật Bản Trung Quốc Nam Á Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu rs17779352 4,5 (1/22) 8,1 5,8 5,6 18,8 4,1 6,3 14,1 rs3802082 68,2 (15/22) 57,4 70,2 70,4 73,8 24 30,9 30,3 rs2066853 64 (73/114) 56,6 71,2 67,6 27,4 70,7 31,7 20,9 rs75519181 1,8 (2/114) 0 2,9 2,9 0 0 0 0 rs779351731 0,9 (1/114) _ _ _ _ _ _ _
Chú thích: Cơ sở dữ liệu biến thể di truyền người (HGVD - Human Genetic Variation Database). Ký hiệu gạch ngang (-) là biểu thị chưa có dữ liệu về tần suất của đa hình.
3.2.3.1. Đa hình trên exon 2 gen AhR
Đa hình trên exon 2 gen AhR đƣợc phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi là c.132T>C (p.N44=), Thymine thay bằng Cytosine tại vị trí 132 trên trình tự mã hóa của DNA (c.DNA - coding DNA), tƣơng ứng amino acid Asparagine (Asn, N) vị trí 44 trên phân tử protein AhR. Đa hình khơng làm thay đổi amino acid. Đa hình này đã đƣợc công bố trên cơ sở dữ liệu dbSNP của NCBI với số hiệu rs17779352.
Tần suất xuất hiện đa hình rs17779352 ở các quần thể ngƣời trên thế giới, theo thống kê trên HGVD trong khoảng 4 đến 8%, tần suất cao ở hai quần thể ngƣời Châu Âu (14,1%) và Nam Á (18,8%) (Bảng 3.7). Theo tác giả Hiromi Fukushima Uesaka và cs (2004), tần suất đa hình rs17779352 ở quần thể ngƣời Nhật Bản là 2,9% [57]. Trong nghiên cứu về đa hình gen AhR ở sáu quần thể ngƣời, Craig J. Rowlands và cs (2010) đã phát hiện thấy đa hình rs17779352 ở các nhóm ngƣời Da trắng, Nhật Bản, Nam Á, Trung Quốc với tỷ lệ % tƣơng ứng là 7,7; 7,7; 28,6 và 5,6 %, trong khi nhóm ngƣời Mỹ gốc Phi và Mexico thì khơng có đa hình này [161]. Theo số liệu đƣợc cơng bố trên HGVD, tần suất đa hình rs17779352 ở ngƣời Kinh sống tại thành phố Hồ Chí Minh là 8,1%. Trong nghiên cứu của chúng tơi, đa hình
dị hợp tử c.132T>C (p.N44=) chỉ thấy có ở một mẫu phơi nhiễm dioxin (mẫu DN92). Trình tự đoạn gen AhR chứa điểm đa hình rs17779352 với kiểu gen TC và kiểu gen TT đƣợc biểu thị trên Hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.132T>C (p.N44=)
(A): Dị hợp tử TC; (B): Đồng hợp tử TT; Mũi tên chỉ vị trí đa hình nucleotide
Trong nghiên cứu này, đa hình rs17779352 (kiểu gen TC) chỉ thấy trong một mẫu ở vùng phơi nhiễm dioxin (mẫu DN92), đối tƣợng mang đa hình là nam giới, có nồng độ TCDD trong máu cao (53,57ppt), đƣợc chẩn đốn mắc bệnh ung thƣ khí quản và tiểu đƣờng type II. Tất cả các mẫu có nồng độ dioxin cao, không mắc bệnh liên quan dioxin đều khơng có đa hình này. Mặc dù các đa hình khơng làm thay đổi amino acid trong phân tử protein nhƣng chúng có thể làm ảnh hƣởng đến độ chính xác, hiệu quả của các quá trình phiên mã, biến đổi hay vận chuyển mRNA, qua đó có thể ảnh hƣởng đến sự biểu hiện của gen. Trong nghiên cứu này, đa hình rs17779352 chỉ xuất hiện duy nhất ở một mẫu nên chƣa có cơ sở để đánh giá mối liên quan giữa đa hình với dioxin ở đối tƣợng có nồng độ dioxin trong máu cao.
3.2.3.2. Đa hình trên intron 5 gen AhR
Khi phân tích trình tự đoạn khuếch đại exon 6 gen AhR, chúng tơi khơng thấy có biến đổi nào trên exon 6, nhƣng phát hiện thấy một biến đổi nucleotide Adenin đƣợc thay bằng Thymine trong vùng intron giữa exon 5 và 6 (c.575-199A>T). Biến đổi này phù hợp với điểm đa hình đƣợc cơng bố trên cơ sở dữ diệu dbSNP của NCBI với mã hiệu là rs3802082.
Phân tích tần suất đa hình rs3802082 ở các quần thể ngƣời trên thế giới theo cơ sở dữ liệu HGVD cho thấy, đa hình rs3802082 chiếm tỷ lệ cao ở các quần thể
ngƣời châu Á (Việt Nam. Nhật Bản, Trung Quốc và Nam Á), tần suất đa hình thấp nhất là của ngƣời Kinh sống ở thành phố Hồ Chí Minh (57,4 %). Trong khi đó, ở các quần thể ngƣời Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Phi, đa hình chỉ chiếm từ 24 đến 31% (Hình 3.7). Trong nghiên cứu của chúng tơi, đa hình rs3802082 xuất hiện ở 15/22 mẫu bao gồm chín mẫu trong vùng phơi nhiễm (các mẫu DN7, DN15, DN9, DN56, DN92, DN18, DN19, DN31, DN32) và sáu mẫu vùng không phơi nhiễm (các mẫu C1, C2, C4, C7, C11, C13) chiếm tỷ lệ 68,2%.
Hình 3.7. Phân bố tần suất đa hình rs3802082 trong nghiên cứu và ở các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD - Human Genetic Variation Database)
Đa hình trong intron mặc dù khơng nằm trong vùng mã hóa, khơng dẫn đến thay đổi amino acid nhƣng có thể ảnh hƣởng đến sự biểu hiện và chức năng gen
AhR; đa hình intron có thể làm tăng hoặc giảm hoạt động phiên mã của gen AhR [163]. Ở tất cả các quần thể ngƣời đƣợc thống kê trên HGVD bao gồm cả ngƣời Kinh sống ở thành phố Hồ Chí Minh, đa hình rs3802082 đều xuất hiện với ba kiểu gen AA, AT và TT. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tơi, đa hình rs3802082 chỉ thấy có hai kiểu gen là AT và TT, đặc biệt là khơng có kiểu gen wild-type (AA) ở tất cả các mẫu đƣợc phân tích. Cần có những nghiên cứu trên số lƣợng mẫu lớn hơn để đánh giá đặc điểm phân bố các kiểu gen của đa hình này có mang tính đặc trƣng riêng biệt cho quần thể ngƣời ở các vùng địa lý khác nhau hay khơng. Trình tự đoạn gen AhR chứa điểm đa hình rs3802082 với các kiểu gen AT và TT biểu thị trên Hình 3.8. 68,2 57,4 70,2 70,4 73,8 24 30,9 30,3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Nghiên cứu
Việt Nam Nhật Bản Trung Quốc
Nam Á Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.575-199A>T
(A): Dị hợp AT; (B): Đồng hợp TT; Mũi tên chỉ vị trí đa hình nucleotide
3.2.3.3. Đa hình trên exon 10 gen AhR
Các nghiên cứu về gen AhR đều cho thấy đa hình gen AhR ở ngƣời chủ yếu xảy ra ở exon 10, vùng mã hóa miền hoạt hóa của thụ thể AhR, đóng vai trị quan trọng trong điều hịa sự biểu hiện các gen đích [22, 50, 77, 95]. Khi phân tích trình tự exon 10 gen AhR ở 114 mẫu, chúng tơi phát hiện thấy có ba điểm đa hình đều dẫn đến thay đổi amino acid (rs2066853, rs75519181, rs779351731). Tần suất allele và kiểu gen của ba đa hình exon 10 gen AhR phát hiện trong nghiên cứu này (n=114) đƣợc trình bày Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Tần suất allele, kiểu gen các đa hình exon 10 gen AhR
Đa hình Kiểu gen Allele HWpval
Các kiểu gen %, (n) Các allele %
Đa hình (1) rs2066853 (n=114) GG 36% (41) G A 61,8% 38,2% 0,4317 GA 51,8% (59) AA 12,3% (14) Đa hình (2) rs75519181 (n=114) GA 1,8% (2) G 99,1% 1 AA 98,2% (112) A 0,9% Đa hình (3) rs779351731 (n=114) TT 99,1% (113) T 99,6% 1 CT 0,9% (1) C 0,4%
Chú thích: HWpval (Hardy-Weinberg p value) là giá trị cân bằng Hardy-Weinberg được kiểm định bằng phần mềm Haploview. Khi HWpval >0,001 thì tần suất các kiểu gen đạt trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg. Trong nghiên cứu này, chúng tơi qui ước 3 đa hình rs2066853, rs75519181, rs779351731 tương ứng là đa hình (1), đa hình (2) và đa hình (3).
Chúng tơi tiến hành kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg tần suất kiểu gen của ba đa hình exon 10 gen AhR phát hiện trong nghiên cứu bằng phần mềm Haploview. Kết quả cho thấy tần suất kiểu gen của cả ba đa hình đều đạt trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg, với giá trị Hwpval >0,001.
Đa hình (1) exon 10 gen AhR: rs2066853
Đặc điểm của đa hình rs2066853 là có sự thay thế Guanine thành Adenine tại vị trí 1661 trên c.DNA, dẫn đến thay thế Arginine (Arg, R) thành Lysine (Lys, K) tại vị trí amino acid 554 trong phân tử protein c.1661G>A (p.R554K). Trình tự đoạn gen AhR chứa điểm đa hình rs2066853 với ba kiểu gen GG, GA và AA đƣợc biểu thị trên Hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.1661G>A (p.R554K)
(A): Đồng hợp tử GG; (B): Dị hợp tử GA; (C): Đồng hợp tử AA; Mũi tên chỉ vị trí đa
hình nucleotide
Trong số các đa hình phát hiện thấy ở exon 10 thì đa hình rs2066853 chiếm tỷ lệ cao nhất, tƣơng đối đồng đều giữa hai vùng phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin. Trong vùng phơi nhiễm, đa hình xuất hiện với tỷ lệ 63,8%, cịn ở vùng khơng phơi nhiễm là 65% (Bảng 3.6). Thống kê ở các chủng tộc ngƣời trên thế giới theo HGVD cho thấy, đa hình rs2066853 chiếm tỷ lệ cao ở hầu hết các chủng tộc ngƣời nhƣ Việt Nam (56,6%), Nhật Bản (71,2%), Trung Quốc (67,6%), châu Phi (70,7%), tần suất thấp hơn đáng kể ở ngƣời Nam Á (27,4%), châu Âu (20,9%) và châu Mỹ (31,7%) (Bảng 3.7). Tần suất đa hình rs 2066853 trong nghiên cứu này là 64%. Chúng tơi phân tích, so sánh tần suất phân bố các allele và kiểu gen của đa
hình rs2066853 trong nghiên cứu này với một số quần thể ngƣời trên thế giới, trong đó có ngƣời Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh (Bảng 3.9)
Bảng 3.9. Phân bố tần suất allele, kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD)
Allele Kiểu gen
Trong nghiên cứu
n=114
Tần suất đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể
Việt Nam Nhật Bản Trung Quốc Nam Á Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu Allele G 61,8 66,7 53,8 59,5 85,4 53,8 82,7 89,2 A 38,2 33,3 46,2 40,5 14,6 46,2 17,3 10,8 Kiểu gen GG 36 43,4 28,8 32,4 72,6 29,3 68,3 79,1 AA 12,3 10,1 21,2 13,3 1,8 21,8 2,9 0,8 GA 51,8 46,5 50 54,3 25,6 48,9 28,8 20,1
Chú thích: Cơ sở dữ liệu biến thể di truyền người (HGVD - Human Genetic Variation Database)
Về tần suất các allele, ở tất cả các quần thể ngƣời, allele G chiếm tỷ lệ cao hơn so với allele A. Ở các quần thể ngƣời Nam Á, châu Mỹ và châu Âu, tần suất allele G cao hơn 5 lần so với allele A. Ở quần thể ngƣời Kinh sống trong thành phố Hồ Chí Minh, allele G (66,7%), allele A (33,3%). Trong nghiên cứu của chúng tôi, tần suất các allele cũng phù hợp với kết quả của các nghiên cứu khác, tần suất allele G chiếm 61,8%, allele A chiếm 38,2%.
Tuy nhiên về tần suất phân bố kiểu gen có sự khác nhau giữa các quần thể ngƣời trên thế giới, trong đó khác biệt nhiều xảy ra với các kiểu gen GG và GA. Ở các quần thể ngƣời Nhật Bản, Trung Quốc, châu Phi tần suất kiểu gen GA cao hơn kiểu gen wild-type GG gấp khoảng 1,7 lần; kiểu gen AA chiếm từ 13 đến 21%. Ngƣợc lại, ở các quần thể ngƣời Nam Á, châu Âu và châu Mỹ tần suất kiểu gen GG cao hơn 2,3 lần kiểu gen GA, kiểu gen AA chiếm tỷ lệ thấp, chỉ từ 0,8 đến 2,9% (Bảng 3.9). Trong nghiên cứu của Craig J. Rowlands và cs (2010), đánh giá chung trên 108 mẫu của sáu quần thể ngƣời (Da trắng, Mỹ gốc Phi, Nhật Bản, Mexico,
Nam Á và Trung Quốc) thì tần suất của allele G chiếm tới 72,2%, allele A chỉ chiếm 27,8%. Tác giả cũng đƣa ra xu thế chung ở các quần thể ngƣời trong nghiên cứu là tần suất kiểu gen GG chiếm tỷ lệ cao nhất, tiếp đến là GA, kiểu gen AA chiếm tỷ lệ từ 1 đến 2%, riêng ở nhóm ngƣời da trắng và Mexico khơng có kiểu gen AA. Điều khác biệt trong nghiên cứu đó là ở nhóm ngƣời Mỹ gốc Phi và Nhật Bản, tần suất allele G và allele A lại tƣơng đƣơng nhau, điều này liên quan đến tần suất kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao hơn kiểu gen GG, ở ngƣời Nhật (GA: 53,8%, GG: 30,8%) ngƣời Mỹ gốc Phi (GA: 44,1%; GG: 32,4%) [161]. Tác giả Akiko Nakamura và cs (2016) cũng đƣa ra kết quả tần suất các allele G và A tƣơng đƣơng nhau ở ngƣời Nhật Bản [127].
Đối với quần thể ngƣời Việt Nam, theo số liệu HGVD, tần suất phân bố các allele G và A của đa hình rs2066853 phù hợp với tần suất allele có ở các quần thể ngƣời khác trên thế giới, allele G (66,7%) chiếm tỷ lệ cao hơn allele A (33,3%). Điều khác biệt đáng chú ý khi so sánh tần suất kiểu gen ở quần thể ngƣời Việt Nam với các quần thể ngƣời trên thế giới đó là: Tần suất hai kiểu gen GG và GA ở quần thể ngƣời Việt Nam lại là tƣơng đƣơng nhau, GG (43,3%) và GA (46,5%) (Bảng
3.9). Khi so sánh đối chiếu tần suất allele và kiểu gen của đa hình rs2066853 trong
nghiên cứu của chúng tơi với quần thể ngƣời Việt Nam cho thấy: Tần suất các allele trong nghiên cứu phù hợp với tần suất allele ở quần thể ngƣời Việt Nam. Trong khi đó tần suất các kiểu gen lại có sự khác biệt: kiểu gen GA (51,8%) cao hơn 1,44 lần kiểu gen GG (36%) (Bảng 3.9). Đa hình rs2066853 trong nghiên cứu của chúng tôi xuất hiện ở cả ba kiểu gen là GG, GA và AA. Tần suất phân bố ba kiểu gen của đa hình rs2066853 ở hai nhóm phơi nhiễm và khơng phơi nhiễm dioxin đƣợc trình bày trong Hình 3.10.
Hình 3.10. Phân bố các kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR ở nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin
Trục tung: Tỷ lệ % đối tượng nghiên cứu. Trục hoành: Các kiểu gen (GG, GA và AA)
của đa hình rs206853 gen AhR. Cột màu đỏ biểu thị nhóm đối tượng phơi nhiễm dioxin.
Cột màu xanh biểu thị nhóm đối tượng khơng phơi nhiễm dioxin..
Ở cả hai nhóm phơi nhiễm và khơng phơi nhiễm dioxin với n=114, tần suất kiểu gen GA đều chiếm tỷ lệ cao hơn kiểu gen GG (Hình 3.10). Kết quả nghiên cứu này khác với kết quả số liệu tần suất các kiểu gen GG và GA của quần thể ngƣời Việt Nam đƣợc công bố trên cơ sở dữ liệu HGVD với n=100 (tần suất kiểu gen GG và GA là tƣơng đƣơng nhau; Bảng 3.9). Khi phân tích kiểu gen của các nhóm
(nhóm 1, nhóm 2 và nhóm 3) trong vùng phơi nhiễm dioxin nói riêng chúng tơi nhận thấy: Sự khác biệt các kiểu gen GG, GA và AA giữa ba nhóm (nhóm 1, nhóm 2 và nhóm 3) khơng có ý nghĩa thống kê với p=0,083 (Bảng 3.10)
Bảng 3.10. Tần suất các kiểu gen (GG, GA, AA) của đa hình rs2066853 gen AhR ở ba nhóm vùng phơi nhiễm dioxin
Nhóm nghiên cứu Kiểu gen: % (n) p
GG GA AA
Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt,
bị bệnh liên quan dioxin
55,6% (15/27) 29,6 % (8/27) 14,8% (4/27) p = 0,083
Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt,
không bị bệnh liên quan dioxin
23,5% (8/34) 64,7% (22/34) 11,8% (4/34)
Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt,
không bị bệnh liên quan dioxin
33,3% ( 11/33) 54,6% (18/33) 12,1% (4/33) 36 51 13 35 55 10 0 10 20 30 40 50 60 GG GA AA Tỷ lệ % Kiểu gen Phơi nhiễm Không phơi nhiễm
Tuy nhiên kết quả Bảng 3.10 cho thấy, ở nhóm 1 (dioxin trong máu ≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin) tần suất kiểu gen GG (55,6%) cao hơn 1,88 lần kiểu gen GA (29,6%). Ngƣợc lại, ở nhóm 2 (dioxin trong máu ≥10 ppt, khơng bị bệnh liên quan dioxin) tần suất kiểu gen GA (64,7%) lại cao hơn 2,75 lần so với kiểu gen GG (23,5%). Để đánh giá sự khác biệt về tần suất các kiểu gen GG, GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 có ý nghĩa thống kê hay khơng, chúng tơi phân tích riêng tần suất của hai kiểu gen GG, GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 (Bảng 3.11)
Bảng 3.11. Tần suất kiểu gen GG và GA của đa hình rs2066853 gen AhR ở nhóm 1 và nhóm 2 vùng phơi nhiễm dioxin
Nhóm nghiên cứu
Kiểu gen: % (n)
p, OR, 95%CI
GG GA
Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt,
bị bệnh liên quan dioxin
65,2 % (15/23) 34,8% (8/23) p = 0,005 OR = 5,156 95%CI: (1,585 – 16,1771)
Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt,
không bị bệnh liên quan dioxin
26,7% (8/30)
73,3% (22/30)
Chú thích: p thu được từ kiểm định χ2 , OR (Odd ratio) - tỷ số chênh. 95%CI (95%