Bảng 3 .2 Các bệnh liên quan dioxin có trong nhóm 1
Bảng 3.5 Chỉ số khối cơ thể (BMI) của đối tƣợng phơi nhiễm dioxin
Đối tƣợng Số
lƣợng Giá trị BMI trung bình
Độ lệch (SD) Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt,
bị bệnh liên quan dioxin 27 22,57 2,39
Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt,
không bị bệnh liên quan dioxin 34 22,07 2,35
Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt,
không bị bệnh liên quan dioxin 33 21,38 2,73
Chú thích: SD (Standard Deviation) – độ lệch chuẩn.
Chỉ số BMI ở ba nhóm đối tƣợng trong vùng phơi nhiễm dioxin khơng có sự khác biệt. Chỉ số BMI có liên quan đến nguy cơ mắc nhiều bệnh lý ở ngƣời, trong đó có ung thƣ. Căn cứ vào bảng đánh giá chỉ số BMI phân loại theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) áp dụng cho ngƣời châu Á (trong đó có Việt Nam), chúng tơi đánh giá thể trạng thừa cân và béo phì trong nhóm phơi nhiễm dioxin (Hình 3.1).
Hình 3.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo chỉ số BMI
Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin. Nhóm 2: dioxin trong
máu ≥10 ppt, không bị bệnh liên quan dioxin. Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt,
không bị bệnh liên quan dioxin.
3,7 51,9 25,9 18,5 5,9 54,9 23,5 15,7 12,1 58,8 21,2 8 0 10 20 30 40 50 60 70
Gầy Bình thường Thừa cân Béo phì
Tỷ lệ %
Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3
Qua phân tích cho thấy, tỷ lệ ngƣời thừa cân ở nhóm 1, nhóm 2 và nhóm 3 tƣơng ứng là 25,9%; 24,5% và 22,5%. Ngƣời béo phì ở nhóm 1 chiếm tỷ lệ 18,5%, ở nhóm 2 là 16%. Trong khi đó tỷ lệ ngƣời béo phì ở nhóm 3 chỉ chiếm 8%. Dioxin khi vào cơ thể đƣợc tích lũy chủ yếu trong các mơ mỡ. Hàm lƣợng dioxin ở nhóm 3 thấp hơn so với nhóm 1 và nhóm 2. Điều này có thể liên quan đến tỷ lệ ngƣời béo phì ở nhóm 3 thấp hơn so với nhóm 1 và nhóm 2.
3.2. ĐA HÌNH CÁC GEN AhR VÀ AIP 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Kết quả đo độ hấp phụ quang phổ các mẫu DNA tổng số đều có chỉ số A260/A280 trong khoảng 1,7 - 1,9. Nồng độ DNA đo đƣợc trong khoảng 18- 73 ng/µl. Sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, nhuộm bằng EtBr (Hình 3.2).
Hình 3.2: Ảnh điện di đồ DNA tổng số
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1-10: các mẫu nghiên cứu đại diện. ĐC: mẫu đối chứng không chứa DNA
Trên ảnh điện di cho thấy, ở tất cả các mẫu đều xuất hiện băng sáng, tập trung, DNA tổng số có chất lƣợng đảm bảo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Khuếch đại các đoạn gen AhR và AIP 3.2.2.1. Khuếch đại các đoạn gen AhR 3.2.2.1. Khuếch đại các đoạn gen AhR
Gen AhR có 11 exon, chúng tơi thiết kế 10 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ 11 exon gen AhR (Bảng 2.1). Sau khi tối ƣu thành phần phản ứng và chu trình nhiệt, chúng tơi thu đƣợc các sản phẩm PCR khuếch đại 11 exon gen AhR
A B C
D E F
G H I
Hình 3.3. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại 11 exon gen AhR
A: Exon 1; B: Exon 2; C: Exon 3; D: Exon 4; E: Exon 5; F: Exon 6; G: Exon 7-8; H: Exon 9 I: Exon 10; K: Exon 11; M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 – 3: các mẫu nghiên cứu đại diện
3.2.2.2. Khuếch đại các đoạn gen AIP
Sử dụng 4 cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.2), chúng tôi thu đƣợc các sản phẩm PCR khuếch đại 6 exon gen AIP (Hình 3.4). Các sản phẩm PCR thu đƣợc là đặc
hiệu, kích thƣớc phù hợp với tính tốn lý thuyết.
A
B
C
D
Hình 3.4. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại 6 exon gen AIP
A: Exon 1; B: exon 2; C: Exon 3; D: Exon 4-5-6; M: thang chuẩn DNA (100 bp đối với
3.2.3. Phân tích đa hình gen AhR
Bƣớc đầu chúng tơi tiến hành phân tích giải tình tự tồn bộ 11 exon của gen
AhR trên 22 mẫu (12 mẫu phơi nhiễm dioxin và 10 mẫu không phơi nhiễm dioxin).
Kết quả phát hiện thấy một đa hình ở exon 2, có ở một mẫu phơi nhiễm dioxin (mẫu DN92). Ngồi ra, cịn có ba đa hình ở exon 10, phát hiện thấy ở cả các mẫu phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin. Các cặp mồi để khuếch đại exon đƣợc thiết kế nhân mở rộng ra cả vùng intron nằm liền kề các exon, mục đích để phát hiện các biến đổi trên vùng intron có thể gây ảnh hƣởng đến quá trình cắt intron, nối exon để tạo mRNA trƣởng thành, kết quả nghiên cứu phát hiện thấy một đa hình trong vùng intron 5 ở chín mẫu phơi nhiễm và sáu mẫu khơng phơi nhiễm. Vị trí các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu đƣợc thể hiện trên Hình 3.5.
Hình 3.5. Sơ đồ cấu trúc gen AhR và
vị trí các đa hình trên gen AhR phát hiện trong nghiên cứu
Ký hiệu E1 đến E11: tương ứng với exon 1 đến exon 11. Mũi tên chỉ vị trí chứa các đa hình. 5’UTR (untranslated region): vùng không mã hóa đầu 5’. 3’UTR (untranslated region): vùng khơng mã hóa đầu 3’.
Exon 10 mã hóa cho vùng hoạt hóa phiên mã, là vùng chức năng quan trọng của thụ thể AhR, đƣợc xác định chứa nhiều đa hình. Vì vậy, chúng tơi tập trung phân tích biến đổi exon 10 trên cỡ mẫu lớn hơn (tổng số 114 mẫu). Tổng hợp kết quả phân tích trình tự 11 exon gen AhR trong nghiên cứu này chúng tơi phát hiện thấy có bốn đa hình trên vùng exon, bao gồm một đa hình trên exon 2 và ba đa hình trên exon 10; vùng intron thấy có một đa hình trong intron 5. Các đa hình đều xuất
nằm trong các exon cịn lại (exon 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 11), ở cả nhóm phơi nhiễm và khơng phơi nhiễm dioxin. Tần suất các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu ở cả vùng phơi nhiễm và khơng phơi nhiễm dioxin đƣợc trình bày ở Bảng 3.6.