Tên
exon
Trình tự mồi (5’ - 3’)
Mồi xi (F - forward); Mồi ngược (R- reverse)
Kích thƣớc sản phẩm PCR (bp) Exon1 F: CCCCGAGACATTCCTAGGCT 466 R: CAATCAGCGTCGAGTTCTGC Exon 2 F: GTGTAAGGTCAGGTGGTGTC 408 R: GCAGTCTAGCAGAGGGTGGA Exon 3 F: TCCCAGTTGTCACTCTCTGG 673 R: GCCCTCGCAGAGATCATGCT Exon 4-5-6 F: GCTCTGCTGCTGGTGTGTGA 1325 R: ACACCAGAGCCTCAGAGCTG Thành phần và điều kiện phản ứng PCR Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với tổng thể tích 25 µl gồm các thành phần thể hiện trong Bảng 2.3. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ gốc Nƣớc khử ion 16,7 Đệm 3,0 10X dNTP 1,0 10mM Mồi xuôi (F) 1,0 10pM Mồi ngƣợc (R) 1,0 10pM
Taq DNA polymerase 0,3 5U/µl Khn DNA 2,0 40-100ng/µl
Tổng thể tích 25
Nhiệt độ gắn mồi, thời gian và số chu kỳ của phản ứng PCR tùy thuộc vào gen và các exon. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR để khuếch đại gen AhR và AIP đƣợc nêu trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Gen Exon Chu trình nhiệt (nhiệt độ/thời gian) Gen Exon Chu trình nhiệt (nhiệt độ/thời gian)
AhR 1, 2, 6, 11 950C/10’ [950C/1’ , 550C/45’’, 720C/90’’]27 720C/10’ 3, 4, 5, 9 950C/10’ [950C/1’ , 600C/45’’, 720C/90’’]27 720C/10’ 7-8, 10 950C/10’ [950C/1’ , 630C/45’’, 720C/90’’]27 720C/10’ AIP 1, 2, 3 95 0C/3’ [950C/1’ , 620C/30’’, 720C/40’’]30 720C/10’ 4-5-6 950C/3’ [950C/1’ , 650C/30’’, 720C/40’’]30 720C/10’ 2.3.5. Giải trình tự gen tự động Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit Wizard SV Gel và PCR Clean-up System (Promega) để loại dNTP và mồi dƣ thừa. Các bƣớc nhƣ sau:
- Bổ sung dung dịch liên kết màng vào dung dịch sản phẩm PCR với thể tích tƣơng đƣơng. Chuyển tồn bộ dung dịch sang cột lọc. Để ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 phút.
- Ly tâm bỏ dịch (14000 vòng/phút trong 1 phút). Thêm 700 l dung dịch rửa màng. Tiếp tục ly tâm bỏ dịch. Rửa cột lần hai với 500 l dung dịch rửa màng, ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút.
- Chuyển cột lọc sang eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung 50 l nƣớc cất. Để ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ cột và thu dịch chứa sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch
Thực hiện phản ứng chu kỳ giải trình tự (cycle sequencing reaction)
Sản phẩm PCR đã đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc thực hiện phản ứng chu kỳ giải trình tự với BigDye Terminator V3.1 (ABI), theo chiều xuôi hoặc ngƣợc cho mỗi đoạn cần đọc. Mỗi phản ứng PCR cho giải trình tự gen bao gồm: 1 µl đệm BigDye 5X, 1 µl mồi nồng độ 1.6 pmol/µl, 1 µl BigDye, 2 µl dung dịch DNA đã đƣợc tinh
sạch, 5,5 l nƣớc khử ion vơ trùng. Chu trình nhiệt trên máy luân nhiệt (MJ Research) nhƣ sau: 960C/1’ [960C/10’’, 500C/5’’, 600C/4’]25
Tinh sạch mẫu sau phản ứng chu kỳ giải trình tự
Sau phản ứng chu kỳ, sản phẩm đƣợc tinh sạch nhằm loại bỏ hoàn toàn các hóa chất thừa có thể ảnh hƣởng tới kết quả điện di vi mao quản. Bổ sung 3 l EDTA 125 mM, 60 l EtOH 100%, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút ở 4ºC để thu tủa DNA. Làm khơ tủa ở nhiệt độ phịng trong 15 phút.
Biến tính mẫu
Bổ sung 10 μL Hi-Di vào từng mẫu và trộn đều. Mẫu đƣợc biến tính bằng máy PCR ở 95°C trong 2 phút trƣớc khi làm lạnh nhanh bằng đá. Các mẫu đƣợc đọc trình tự trên máy giải trình tự gen ABI 3500 Genetic Analyzer. Các nucleotide trên gen sẽ đuợc biểu hiện bằng các đỉnh (peak) với 4 màu tƣơng đƣơng với 4 loại nucleotide A, T, G, C.
2.3.6. Giải trình tự tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES) 2.3.6.1. Chuẩn bị mẫu 2.3.6.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu máu toàn phần của đối tƣợng nghiên cứu đƣợc tách chiết DNA tổng số bằng kit QIAamp DNA Blood Midi Kit của hãng QIAGEN, tiến hành theo qui trình của nhà sản xuất. Sản phẩm DNA tổng số đƣợc kiểm tra đánh giá bằng kit Qubit® dsDNA HS Assay, sử dụng thiết bị định lƣợng acid nucleic Qubit® 2.0
2.3.6.2. Thiết lập thư viện DNA
Chúng tôi sử dụng kit SureSelect Target Enrichment system for illumina paired - end multiplex sequencing để thiết lập thƣ viện DNA cho giải trình tự tồn bộ exome. Các bƣớc chính nhƣ sau:
Bƣớc 1: Phân cắt DNA. Khoảng 3 µg DNA tổng số đƣợc phân cắt thành các đoạn có kích thƣớc 150 - 200 bp theo các điều kiện của máy CovarisE210.
Bƣớc 2: Tinh sạch DNA bằng hạt từ AMPure XP Bead. Để hạt từ AMPure XP Bead ở nhiệt độ phịng ít nhất 30 phút, trộn đều để các hạt từ phân tán đồng nhất
trong dung dịch. Thêm 180 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất vào các giếng chứa DNA đã cắt và trộn đều. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 phút. Đặt khay chứa mẫu lên giá từ đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Loại bỏ dịch nổi phía trên. Rửa các hạt từ 2 lần bằng 500 µl ethanol, mỗi lần 1 phút. Làm khô các hạt từ bằng cách đặt khay mẫu vào máy luân nhiệt. Cài đặt nhiệt độ 37 oC trong 5 phút. Thêm 50 µl nƣớc không chứa nuclease vào mỗi giếng, trộn đều. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Đặt khay mẫu trở lại giá từ và chờ đến khi dung dịch trong suốt (khoảng 5 phút), sau đó chuyển dịch nổi chứa DNA sang khay đựng mẫu mới.
Bƣớc 3: Làm bằng 2 đầu các đoạn DNA thu đƣợc. Sử dụng bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit. Thành phần phản ứng nhƣ sau:
Hóa chất
Mẫu DNA đã đƣợc phân cắt 10X End Repair Buffer dNTP mix
Nƣớc (không chứa nuclease) T4 DNA Polymerase
Klenow DNA Polymerase T4 Polynucleotide Kinase Tổng thể tích Thể tích (µl) ~50 10 1,6 33,2 1 2 2,2 100
Ủ hỗn hợp phản ứng trong 30 phút ở 20 oC trong máy luân nhiệt. Tinh sạch sản phầm DNA (tƣơng tự bƣớc 2, sử dụng 32 l nƣớc không nuclease).
Bƣớc 4: Gắn Adenine vào đầu các đoạn DNA. Sử dụng kit SureSelectXT Human All Exon Kit cho bƣớc này. Thành phần phản ứng nhƣ sau:
Hóa chất
Mẫu DNA thu đƣợc ở bƣớc 3 10X Klenow Polymerase Buffer Nƣớc (không chứa nuclease) dATP Exo(-) Klenow Tổng thể tích Thể tích (µl) ~32 5 9 1 3 50
Ủ hỗn hợp phản ứng trong máy luân nhiệt ở 37 oC trong 30 phút. Tiến hành tinh sạch sản phẩm DNA thu đƣợc (cách làm tƣơng tự nhƣ bƣớc 2, điểm khác là sử dụng 90 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hòa tan DNA bằng 28,5 l nƣớc không chứa nuclease).
Bƣớc 5: Gắn adaptor. Sử dụng bộ kít SureSelectXT Human All Exon Kit.Thành phần hỗn hợp gắn adaptor nhƣ sau:
Hóa chất
Mẫu DNA thu đƣợc ở bƣớc 4 5X T4 DNA ligase buffer SureSelect Adaptor Oligo Mix T4 DNA ligase Tổng thể tích Thể tích (µl) ~28,5 10 10 1,5 50 Ủ hỗn hợp phản ứng trong máy luân nhiệt ở 20 o
C trong 15 phút. Tinh sạch sản phẩm DNA thu đƣợc (làm tƣơng tự nhƣ bƣớc 2, chỉ khác là sử dụng 90 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hịa tan DNA bằng 32 l nƣớc khơng chứa nuclease).
Bƣớc 6: Khuếch đại phân đoạn DNA gắn adaptor theo SelectXT Human All Exon Kit và Herculase II Fusion DNA polymerase. Thành phần nhƣ sau
Hóa chất
Mẫu thƣ viện DNA đã tinh sạch Nƣớc (không chứa nuclease) SureSelect primer
SureSelect ILM indexing pre capture PCR reverse primer Đệm 5X Herculase II
Hỗn hợp dNTP 100mM
Herculase II Fusion DNA Polymerase Tổng thể tích Thể tích (µl) 15 21 1,25 1,25 10 0,5 1 50 Chu trình nhiệt phản ứng: 980C/2’ [980C/30’’, 650C/30’’, 720C/1’]6 720C/10’. Tinh sạch sản phẩm phản ứng: cách làm tƣơng tự nhƣ bƣớc 2 (sử dụng 90 µl dung
dịch hạt từ đã đồng nhất và hòa tan DNA bằng 30 l nƣớc không chứa nuclease). Đánh giá chất lƣợng và nồng độ của thƣ viện DNA: sử dụng DNA 1000 LabChip trên máy 2100 Bioanalyzer theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.6.3. Làm giàu thư viện DNA
Chuẩn bị dung dịch đệm lai cho mỗi mẫu bằng các hóa chất của bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit, thành phần nhƣ sau:
Hóa chất SureSelect Hyb #1 SureSelect Hyb #2 SureSelect Hyb #3 SureSelect Hyb #4 Tổng thể tích Thể tích (µl) 25 1 10 13 49
Chuẩn bị dung dịch Block Mix bằng các hóa chất của bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit. Thành phần cho mỗi mẫu nhƣ sau:
Hóa chất
SureSelect Indexing Block #1 SureSelect Block #2
SureSelect Indexing Block #3 Tổng thể tích Thể tích (µl) 2.5 2.5 0.6 5.6
Pha lỗng dung dịch SureSelect Rnase Block với nƣớc (khơng chứa nuclease) theo tỷ lệ 1:2. Chuẩn bị dung dịch Capture Library Mix theo bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit, các hóa chất đƣợc giữ trên đá trong quá trình tiến hành. Thành phần cho mỗi mẫu nhƣ sau:
Hóa chất
SureSelect Human All Exon 50M Library SureSelect RNase Block
Tổng thể tích
Thể tích (µl)
5 2 7
Trộn 3,4 µl mẫu dung dịch thƣ viện DNA đã tinh sạch với 5,6 µl Block Mix. Tra hỗn hợp vào giếng ở hàng B của đĩa PCR - 96 giếng. Biến tính hỗn hợp ở 950C trong 5’, sau đó giữ ở 650
C.
Thêm 40 µl dung dịch đệm lai vào các giếng tƣơng ứng trong cùng một cột ở hàng A và ủ ở 650C trong 5 phút. Tƣơng ứng với các giếng trong cùng một cột ở hàng C, thêm 7 µl dung dịch Capture Library Mix và tiếp tục ủ ở 650C trong 2 phút.
Hút 13 µl dung dịch đệm lai từ hàng A chuyển vào cột tƣơng ứng ở hàng C. Hút dung dịch trong các giếng ở hàng B chuyển vào các cột tƣơng ứng ở hàng C. Dùng pipette đảo trộn đều 10 lần. Ủ trong máy luân nhiệt ở 650C trong 24h với nắp đậy cài đặt 1050C.
Tiến hành lai gắn DNA với hạt từ Dynabead thực hiện các bƣớc theo MyOne Streptavidin T1, sau đó tinh sạch mẫu làm tƣơng tự bƣớc 2 (sử dụng 180 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hịa tan DNA bằng 30 l nƣớc khơng chứa nuclease).
Thành phần phản ứng khuếch đại thƣ viện DNA chuẩn bị theo SelectXT Human All Exon Kit và Herculase II Fusion DNA polymerase. Thành phần của phản ứng nhƣ sau:
Hóa chất Thể tích (µl)
Mẫu thƣ viện DNA gắn hạt từ đã tinh sạch Nƣớc (không chứa nuclease)
PCR primer (Index 1-Index 16)
SureSelect ILM indexing post-capture forward PCR primer Dung dịch đệm 5X Herculase II
Hỗn hợp dNTP 100mM
Herculase II Fusion DNA Polymerase
14 22,5 1 1 10 0,5 1 Tổng thể tích 50 Chu trình nhiệt phản ứng: 980C/2’ [980C/30’’, 570C/30’, 720C/1’]12 720C/10’. Tinh sạch thƣ viện đã đƣợc khuếch đại tƣơng tự nhƣ bƣớc 2 (sử dụng 90 µl dung dịch hạt từ đã đồng nhất và hòa tan DNA bằng 30 l đệm EB của hãng QIAGEN).
2.3.6.4. Đánh giá thư viện DNA sau khi làm giàu
Thƣ viện DNA đƣợc định lƣợng bằng cách sử dụng kit Qubit Fluorometer BR (Broad range) DNA theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Điện di 1 µl thƣ viện đã đƣợc làm giàu bằng máy Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer, sử dụng chip High Sensitivity DNA. Kì vọng sự phân bố của các đoạn DNA có kích thƣớc từ 200 - 400 bp.
2.3.6.5. Giải trình tự bằng máy Illumina Nextseq-500
Các bƣớc giải trình tự trên máy Illumina đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Dữ liệu thu đƣợc từ máy giải trình tự gen đƣợc định dạng dƣới dạng file fastq. Dữ liệu đƣợc phân tích tin sinh học để xác định các biến thể di truyền, chú giải và sàng lọc các biến thể di truyền.
2.3.7. Xử lý số liệu và tính tốn thống kê
Trình tự các đoạn DNA khuếch đại gen AhR và gen AIP đƣợc so sánh, phân tích với các trình tự tham chiếu gen AhR (số hiệu ENSG00000106546) và gen AIP
(số hiệu ENSG00000110711) đƣợc công bố trên cơ sở dữ liệu Ensemble
(https://www.ensembl.org/ ). Kết quả đọc trình tự gen đƣợc phân tích bằng phần mềm Expasy 2.5 và BioEdit v7.0. Để phân tích và dự đốn ảnh hƣởng của các đa hình gen AIP lên cấu trúc cũng nhƣ chức năng của protein, chúng tôi sử dụng phần mềm Swiss-PdbViewer và cấu trúc 3D protein AIP của ngƣời với mã số 2LKN và 4APO trên ngân hàng dữ liệu protein PDB (Protein Data Bank). Phần mềm Swiss- PdbViewer cho phép xây dựng hình mơ phỏng cấu trúc không gian protein, biểu hiện các liên kết trong phân tử protein và phân tích thay đổi trong cấu trúc protein khi có sự thay thế các amino acid. Đối với protein AhR, trên ngân hàng dữ liệu protein PDB (Protein Data Bank) mới chỉ có cấu trúc 3D protein AhR của ngƣời ở các vùng bHLH (basic Helix-Loop-Helix) và PAS (Per-Arnt-Sim) với mã số 5NJ8 và 5VOL. Hiện nay chƣa có dữ liệu cấu trúc 3D của protein AhR của ngƣời ở vùng hoạt hóa phiên mã (tƣơng ứng exon 10 gen AhR). Protein AhR ở các lồi sinh vật có trình tự tƣơng đồng cao với protein AhR của ngƣời cho đến nay cũng chƣa có cấu
Tần suất đa hình các gen AhR và AIP trong nghiên cứu đƣợc phân tích so
sánh với tần suất các đa hình tƣơng ứng ở các quần thể ngƣời trên thế giới, dựa trên cơ sở dữ liệu biến thể di truyền ngƣời (HGVD - Human Genetic Variation Database, w.w.w.hgvd.genome.med-u.acjp). Tần suất các allele và kiểu gen của các đa hình đƣợc kiểm định cân bằng Hardy - Weinberg bằng phần mềm Haploview. Các biến đổi di truyền trong nghiên cứu đƣợc coi là đột biến mới khi chƣa đƣợc công bố trên cơ sở dữ liệu đa hình đơn nucleotide (dbSNP - Single Nucleotide Polymorphism Database, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) của Trung tâm Quốc gia về Thông tin công nghệ sinh học, Mỹ (NCBI - National Center for Biotechnology Information) và cơ sở dữ liệu đột biến gen ngƣời (HGMD - Human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk/). Sử dụng chƣơng trình MS Excel 2013 và phần mềm thống kê SPSS. 23 với các kiểm định thống kê thƣờng dùng để phân tích số liệu, kết quả nghiên cứu.
Dữ liệu thô thu đƣợc từ giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) đƣợc phân tích tin sinh học, phát hiện và chú giải các biến thể di truyền. Bộ công cụ GATK sử dụng phát hiện các biến thể di truyền. Phần mềm SnpEff sử dụng để phân chia các biến thể thành các nhóm theo mức độ ảnh hƣởng chức năng của biến thể. Để dự đoán ảnh hƣởng của các biến thể di truyền đến chức năng của protein, sử dụng công cụ SIFT (Sorting intolerant from tolerant) và Polyphen-2 (Polymorphism phenotyping V2). Với cơng cụ SIFT có thể dự đốn xem một thay thế amino acid có thể ảnh hƣởng đến chức năng của protein hay không dựa trên sự tƣơng đồng về trình tự và đặc tính giữa các amino acid thay thế. Công cụ Polyphen dự đoán ảnh hƣởng của amino acid thay thế lên cấu trúc và chức năng của protein dựa trên sự tƣơng đồng về trình tự, cấu trúc 3D. Các biến thể di truyền có chỉ số Polyphen trong khoảng 0,957 đến 1 là có hại, giá trị trong khoảng 0,453 đến 0,956 là có thể gây hại và các biến thể có điểm đánh giá trong khoảng 0 đến 0,452 là khơng có hại.
2.4. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Tất cả các đối tƣợng đều tình nguyện tham gia nghiên cứu và họ có thể dừng tham gia bất cứ lúc nào họ muốn.
Thông tin cá nhân của các đối tƣợng nghiên cứu đƣợc bảo mật và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Các số liệu và kết quả nghiên cứu chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu khoa học, khơng sử dụng vào mục đích nào khác.
Nghiên cứu đƣợc triển khai thực hiện với sự đồng ý của các chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nƣớc mã số KHCN - 33.04/11-15 và đề tài NAFOSTED mã số 106 - YS.01 - 2014.34. Các đề tài này đã đƣợc thông qua Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh của Học viện Quân y và Viện nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Chúng tơi phân tích chỉ số sinh học của 114 mẫu (94 mẫu phơi nhiễm và 20 mẫu không phơi nhiễm dioxin). Các mẫu phơi nhiễm dioxin đƣợc phân thành ba nhóm: Nhóm 1 - nhóm có hàm lƣợng TCDD cao ≥ 10 ppt, mắc các bệnh liên quan đến dioxin (n=27); Nhóm 2 - nhóm có hàm lƣợng TCDD cao ≥10 ppt, khơng mắc bệnh liên quan dioxin (n=34); Nhóm 3 - nhóm có hàm lƣợng TCDD <10 ppt, khơng mắc bệnh liên quan dioxin (n=33).
Bảng 3.1. Phân nhóm đối tƣợng nghiên cứu
Nhóm đối tƣợng Số lƣợng Tổng
Không phơi nhiễm dioxin 20 20
Phơi nhiễm dioxin
Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt
và bị bệnh liên quan dioxin 27
94 Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt
và khơng bị bệnh liên quan dioxin 34
Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt
và không bị bệnh liên quan dioxin 33
Tổng 114