Từ hình 3.4 chúng ta thấy hoạt độ enzyme α-Gal A trung bình theo nhóm tuổi chênh lệch khơng nhiều. Điều này cho thấy rằng độ tuổi không ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme. Hoạt độ enzyme cao hay thấp tuỳ thuộc vào tình trạng từng bệnh nhân. Độ tuổi từ 20 – 30 tuổi có hoạt độ enzyme thấp có thể là do số lượng mẫu ít, khơng đủ điều kiện để khẳng định hoạt độ enzyme nhóm tuổi này suy giảm vì độ tuổi.
3.2. Kết quả giải trình tự gen GLA
3.2.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự Bảng 3.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự Bảng 3.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự
Kí hiệu mẫu Giới tính Hoạt độ enzyme GLA Tuổi LVMI (g/m2) LVPWd (mm) FB01 Nữ 1.79 75 135.00 11.00 FB02 Nam 1.40 81 221.00 16.30 FB03 Nam 0.89 78 174.00 9.60 FB04 Nam 1.59 80 169.00 13.00 FB05 Nam 2.13 29 150.00 14.60 FB06 Nữ 1.52 80 142.00 10.40 FB07 Nữ 1.92 59 140.00 11.00 FB08 Nữ 1.61 73 151.00 13.60 FB09 Nữ 2.62 65 134.00 11.10 FB10 Nữ 1.46 59 128.00 11.90 FB26 Nam 0.54 21 145.00 10.30 FB44 Nam 0.47 58 117.00 13.00 FB64 Nam 0.17 56 205.00 22.60 FB69 Nam 0.53 60 237.00 14.90 FB70 Nam 0.61 74 212.00 13.00 FB74 Nam 0.54 72 172.00 14.30 FB79 Nam 0.52 56 167.00 14.00 FB80 Nam 0.61 76 151.00 10.20 FB84 Nam 0.50 52 135.00 9.60 FB85 Nam 0.32 75 159.00 14.00 FB133 Nam 0.32 60 146.00 9.40 FB331 Nam 0.80 48 129.00 14.30 FB334 Nam 1.11 41 146.00 12.50 FB345 Nam 1.17 43 170.00 15.80 FB378 Nam 0.99 50 165.00 12.00 FB414 Nam 1.01 48 147.00 17.00
Các mẫu được lựa chọn để giải trình tự là các mẫu có hoạt độ enzyme thấp nhất trong các đợt phân tích. Trong số 26 mẫu được giải trình tự có 20 mẫu của nam và 6 mẫu của nữ. Hoạt độ enzyme nằm trong khoảng từ 0.17 – 2.62 µmol/h/L, giá trị mean ± SD là 1.04 ± 0.64 µmol/h/L (≤ 10% giá trị hoạt độ bình thường). Độ tuổi của nhóm bệnh nhân này từ 21 – 81 tuổi.
Các chỉ số về cơ tim gồm có chỉ số khối lượng cơ thất trái (LVMI) và chỉ số bề dày thành sau thất trái thì tâm trương (LVPWd). Hai chỉ số này là hai chỉ số quan trọng nhất trong đánh giá phì đại cơ tim trên bệnh nhân. Do tâm thất trái là buồng bơm chính của tim đưa máu đi ni cơ thể nên có hoạt động trao đổi chất và vận động cơ học nhiều nhất. Đây là nguyên nhân khi sàng lọc các bệnh nhân phì đại cơ tim thì chỉ số LVMI và LVPWd rất quan trọng.
Chỉ số LVMI và LVPWd của người bình thường và bệnh nhân phì đại cơ tim được trình bày trong bảng 3.2. Bệnh nhân được lựa chọn nghiên cứu là những bệnh nhân có một trong hai hoặc cả hai chỉ tiêu LVMI và LVPWd bất thường.
Bảng 3.2. Các chỉ số LVMI, LVPWd của người bình thường và bệnh nhân phì đại cơ tim.
Như vậy, trong số 26 mẫu lấy từ các bệnh nhân phì đại cơ tim có hoạt độ enzyme α-Gal A suy giảm mạnh, 23 mẫu có khối lượng cơ thất trái ≥ 134 g/m2 (chiếm 88.46%), 16 mẫu có bề dày thành sau thất trái thì tâm trương ≥ 12 mm (chiếm 61.54%). Điều này thêm phần khẳng định rằng tâm thất trái là phần dễ bị phì đại nhất của tim và hoạt động bất thường của enzyme α-Gal A là nguyên nhân chính hoặc một trong số các nguyên nhân gây phì đại cơ tim ở nhóm bệnh nhân này.
Tiêu chí LVMI (g/m2) LVPWd (mm) Nam Nữ
Người bình thường 100.77 ± 19.96 86.34 ± 16.87 7 ±1 Bệnh nhân phì đại cơ tim ≥ 134 ≥ 110 ≥ 12
3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn gen GLA
Theo thống kê, tính đến năm 2010 đã phát hiện khoảng 600 biến đổi trong trình tự gen GLA gây bệnh Fabry. Các đột biến được tìm thấy khơng nằm ở vị trí
nhất định (hot spot) mà có thể ở bất cứ vị trí nào trên 7 exon của gen [23]. Ngồi ra, một số nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra đột biến IVS4 +919 G>A, một đột biến ở intron 4 xuất hiện với tần số khá cao (có thể lên tới 1/1600 trẻ sơ sinh). Đột biến này chủ yếu gặp ở khu vực châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và được xác định là có thể ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme α – Gal A và có liên quan đến bệnh tim khởi phát muộn [30, 34, 44, 69]. Do đó, chúng tơi đã lựa chọn nhân bản và xác định trình tự 7 exon và 1 đoạn intron 4 để phát hiện bất thường ở gen GLA của
một số mẫu có hoạt độ enzyme α – Gal A suy giảm mạnh.
3.2.2.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR
Sau khi nhân bản ADN bằng phản ứng PCR 7 exon, 1 đoạn intron để thực hiện bước tiếp theo là giải trình tự các đoạn ADN được nhân lên từ phản ứng PCR, điều trước tiên và cũng rất quan trọng đó là làm sạch các đoạn ADN này. Chúng tôi lựa chọn phương pháp điện di trên gel agarose và thôi băng ADN cần thiết từ gel agarose. Phương pháp điện di và thơi băng đã được trình bày ở phần phương pháp.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR 7 exon và intron 4 của mẫu FB26, FB44; FB64; FB69 M: Marker 100 bp 1: Mẫu FB26 2: Mẫu FB44 3: Mẫu FB64 4: Mẫu FB69 695 bp 445 bp
Từ hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm PCR thể hiện trên băng rất gọn, rõ, kích thước phù hợp khi đo với thang chuẩn, khơng có băng phụ. Sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao và đạt tiêu chuẩn để thực hiện các bước tiếp theo.
3.2.2.2. Kết quả đo OD sản phẩm tinh sạch
Sản phẩm sau khi tinh sạch được định lượng trên máy đo quang phổ. Kết quả đo OD của 26 mẫu thu được trình bày ở bảng 3.3 và phần phụ lục 2.
Bảng 3.3. Kết quả đo OD260; OD280 và nồng độ ADN sản phẩm PCR của mẫu FB01. Sản phẩm OD260 OD280 260/280 Độ pha lỗng Nồng độ µg/ml Exon 1 0.0326 0.0167 1.943 20 32.6 Exon 2 0.0310 0.0157 1.911 20 31.0 Exon 3 0.0285 0.0156 1.822 20 28.5 Exon 4 0.0291 0.0162 1.796 20 29.1 Intron 4 0.0327 0.0175 1.864 20 32.7 Exon 5,6 0.0335 0.0184 1.821 20 33.5 Exon 7 0.0294 0.0158 1.862 20 29.4
Từ kết quả đo OD cho thấy lượng ADN thu được sau khi thôi gel là không nhiều nhưng tương đối đồng đều và độ sạch là khá cao (OD260/OD280 ≥1,8). Sản phẩm đủ tiêu chuẩn làm khn cho phản ứng PCR giải trình tự.
3.2.3. Phát hiện các đột biến trên gen GLA
Chúng tôi đã giải trình tự 26/421 mẫu và cho kết quả là 1 đột biến ở exon 1 và 5 dạng đột biến IVS (intervening sequence) ở intron và 5’ UTR (untranslate region). Kết quả giải trình tự 26 mẫu được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả giải trình tự 26 mẫu
Kí hiệu mẫu
exon 1 Intron 1 exon
2 exon 3 exon 4 intron 4 exon 5 exon 6 Intron 6 exon 7
FB01 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB02 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB03 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB04 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB05 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB06 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB07 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB08 BT IVS1+17 A>G BT BT BT BT BT BT BT BT
FB09 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB10 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB26 5'UTR -12 G>A BT BT BT BT BT BT BT IVS6-22 C>T BT
FB44 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB70 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB74 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB79 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB80 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB84 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB85 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB133 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB331 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB334 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB345 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB378 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
Hình 3.7. Đoạn trình tự exon 1 đột biến c.[178 C>T] ; [0], p.P60S
Trong số 26 mẫu được giải trình tự, chỉ có duy nhất một mẫu FB 64 có đột biến ở vùng mã hố axit amin thuộc exon 1. Đó là đột biến điểm ở vị trí nucleotide 178 thay thế C bằng T dẫn tới sự thay đổi axit amin thứ 60 từ Proline thành Serine. Đây là đột biến mới chưa từng công bố trong y văn. Mẫu đột biến FB 64 là mẫu có hoạt độ enzyme α – Gal A bằng 0.17, thấp nhất trong số 26 mẫu được giải trình tự. Bệnh nhân FB 64 là bệnh nhân nam 56 tuổi. Kết quả siêu âm cho thấy các chỉ số LVMI bằng 205 g/m2, LVPWd bằng 22.6 mm đều rất cao. Bệnh nhân này chỉ biểu
c.[178 C>T] ; [0], p.P60S
hiện các đặc điểm của bệnh Fabry thể khơng điển hình như phì đại cơ tim với các triệu chứng khó thở, đau thắt ngực, tim đập nhanh đặc biệt là khi lao động hoặc vận động mạnh, ngồi ra khơng mang các đặc điểm khác của bệnh Fabry thể điển hình. Như vậy, tỉ lệ đột biến gen GLA gây bệnh Fabry ở nhóm bệnh nhân phì đại cơ tim trong nghiên cứu này là 1/421.
Trong nghiên cứu của Nakao và cộng sự năm 1995 trên 230 bệnh nhân nam phì đại cơ tim đã phát hiện 2 đột biến gen GLA ở vùng mã hoá axit amin thuộc exon 1 và exon 6, có 5 bệnh nhân khơng có đột biến ở vùng mã hố axit amin nhưng có α – galactosidase mARN giảm rõ rệt so với bình thường. Cả 7 bệnh nhân này đều biểu hiện các đặc điểm của bệnh Fabry khơng điển hình [55]. Năm 2002, B Sachdev và cộng sự nghiên cứu trên 153 bệnh nhân nam phì đại cơ tim khởi phát muộn đã phát hiện ra 6 bệnh nhân bị đột biến gen GLA với 4 dạng đột biến khác nhau gồm 3 đột biến thay thế và 1 đột biến mất nucleotide [11]. Năm 2011, Albert A Hagege và cộng sự cũng sàng lọc trên 392 bệnh nhân phì đại cơ tim và phát hiện ra 4 đột biến gen GLA [6]. Năm 2010, Ole Havndrup đã nghiên cứu 90 đối tượng và người thân của họ, nhóm tác giả loại trừ 31 trường hợp có đột biến gen sarcomer, trong 59 trường hợp còn lại họ đã phát hiện được 3 đột biến gen GLA [57].
Như vậy tỉ lệ đột biến gen GLA khi sàng lọc các bệnh nhân phì đại cơ tim
trong các nghiên cứu là rất khác nhau. Điều này có thể do sự khác nhau giữa các dân tộc, quốc gia, hoặc cũng có thể do số lượng mẫu đem sàng lọc chưa đủ lớn để đưa ra một tỷ lệ chung.
Ngoài một đột biến duy nhất ở vùng mã hoá axit amin của exon 1, bảng 3.4 cho thấy có 5 dạng đột biến IVS và 5’UTR xuất hiện với tần số khá cao. Có tới 13/26 mẫu mang ít nhất 1 trong 5 dạng đột biến này. Trong đó 10/26 mẫu (38%) mang đột biến 5'UTR -10 C>T, 12/26 mẫu (46%) mang đột biến IVS4-16 A>G, 13/26 mẫu (50%) mang đột biến IVS6-22 C>T, 10/26 mẫu (38%) mang cả 3 loại đột biến trên. Ngoài ra cịn có hai dạng đột biến là IVS1+17 A>G và 5'UTR -12
Hình 3.8. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -12 G>A
Hình 3.10. Đoạn trình tự nucleotide có đột biến IVS1+17 A>G
Ở Đài Loan đã có một nghiên cứu sàng lọc lớn trên 110 027 trẻ sơ sinh, kết quả cho thấy có một dạng đột biến “hotspot” phổ biến trong cộng đồng là đột biến IVS4+919 G>A với tỷ lệ 1/1600 trẻ [32]. Một số nghiên cứu cũng cho thấy rằng đột biến IVS4+919 G>A có thể ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme α – Gal A và có liên quan đến một số biểu hiện bệnh tim khởi phát muộn [34, 44, 69]. Năm 2006, Junaid Shabbeer và cộng sự đã phát hiện ra 50 đột biến trên gen GLA, trong đó có 5 đột
biến IVS, 1 trong 5 đột biến đó (IVS5 + 3A >G) tạo nên 2 sản phẩm phiên mã bất thường [39]. Ellen Schäfer và cộng sự tìm ra 34 đột biến mới trên 121 bệnh nhân Fabry, có tới 5.6 % mang các đột biến IVS [25]. Khi Christine M. Eng và cộng sự nghiên cứu trên các bệnh nhân Fabry thể điển hình, họ đã phát hiện được 35 dạng đột biến gen GLA trong đó có 1 đột biến IVS [19]. Một số nghiên cứu khác trong
các gia đình có người mắc bệnh Fabry cũng phát hiện ra nhiều đột biến IVS và 5’UTR. Robert Dobrovolny và cộng sự đã phát hiện 21 đột biến gen GLA ở 22 gia đình Fabry, trong đó có 3 đột biến IVS [63]. Diana Blaydon và cộng sự đã nghiên cứu trên 35 gia đình Fabry và tìm thấy 20 đột biến mới ở gen GLA trong đó có 1 đột biến IVS [24]. Theo thống kê, trong số 599 đột biến gen GLA ở bệnh nhân Fabry, có 7.4% là các đột biến ở vị trí cắt nối (splice site) [23]. Các kết quả trên cho thấy các dạng đột biến IVS là khá phổ biến. Các đột biến 5’ UTR ít được tìm thấy hơn và
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy 3 loại đột biến 5'UTR -10 C>T; IVS4-16 A>G; IVS6-22 C>T xuất hiện với tần số rất cao, đây có thể là các đột biến “hotspot” hoặc đa hình trong cộng đồng người Việt Nam. Chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của các đột biến này đến sự biểu hiện của gen GLA, hoạt độ enzyme α – Gal A cũng như sự liên quan của các đột biến này đối với bệnh phì đại cơ tim. Cần có những cơng trình nghiên cứu sàng lọc trên số lượng lớn cá thể để có thể đưa ra được kết luận chính xác.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme α – Gal A của 421 mẫu máu lấy từ các bệnh nhân phì đại cơ tim cho thấy hoạt độ enzym có giá trị từ 0.17 – 9.18 µmol/h/L, giá trị mean ± SD bằng 1.84 ± 0.93 µmol/h/L. Kết quả này được đánh giá là thấp hơn so với một số nghiên cứu trên thế giới.
2. Kết quả phân tích gen GLA của 26 mẫu có hoạt độ enzyme α – Gal A suy giảm mạnh đã phát hiện ra 6 đột biến, trong đó có 1 đột biến thay thế nucleotide c.[178 C>T] ; [0], p.P60S ở vùng mã hoá axit amin thuộc exon 1. Đây là đột biến mới chưa từng được công bố trong y văn. Các đột biến còn lại là các đột biến ở vùng 5’UTR và intron bao gồm: 5'UTR -10 C>T; IVS4-16 A>G; IVS6-22 C>T; IVS1+17 A>G và 5'UTR -12 G>A. Trong đó các đột biến 5'UTR -10 C>T; IVS4-16 A>G; IVS6-22 C>T xuất hiện với tần số khá cao, và có tới 10/26 mẫu mang cả 3 loại đột biến trên.
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả trên, tôi xin đưa ra một số kiến nghị như sau:
1. Mở rộng nghiên cứu sàng lọc bệnh Fabry bằng phương pháp xác định hoạt độ enzyme α – Gal A trên đối tượng phì đại cơ tim và người bình thường từ đó xác định dải tham chiếu về hoạt độ enzyme enzyme α – Gal A ở người Việt Nam.
2. Đi sâu nghiên cứu về biểu hiện gen GLA trên đối tượng phì đại cơ tim, góp phần giải thích ngun nhân hoạt độ enzyme α – Gal A trên đối tượng này thấp hơn so với một số nghiên cứu trên thế giới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hoá sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam.