Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.2.5. Giải trình tự gen GLA
Trình tự gen GLA được xử lý bằng cách sử dụng kít giải trình tự chu kỳ
BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) và máy giải trình tự ABI Prism 3730. Hệ thống giải trình tự này hoạt động dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger. Sản phẩm tinh sạch sẽ được tiến hành PCR giải trình tự (cycle sequencing) sử dụng kít giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3. Kit này đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết cho phản ứng nhân gen để đọc trình tự như ddNTP; dNTP; ADN polymerase… Do đó chỉ cần bổ sung thêm ADN khuôn là sản phẩm đã tinh sạch và mồi. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng nhân bản. Thành phần Số lƣợng Mồi 3,2 pmol ADN khn Bảng 2.6 BigDye 8 µl H2O Cho đủ 20 µl
Bảng 2.6. Hàm lượng ADN khn cho phản ứng PCR giải trình tự
ADN khn Số lƣợng 100 – 200 bp 1 - 3 ng 200 – 500 bp 3 – 10 ng 500 – 1000 bp 5 – 20 ng 1000 – 2000 bp 10 – 40 ng > 2000 bp 20 – 50 ng
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự.
Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
960C 1 phút 1 960C 10 giây 25 500C 5 giây 600C 4 phút 40C Bảo quản
Sảm phẩm PCR giải trình tự được làm sạch bằng phương pháp Ethanol/EDTA của hãng Applied BioSysterms cũng cấp. Quy trình thực hiện gồm các bước sau:
- Cho vào mẫu 60µl ethanol 100%, 5 µl EDTA 125mM và trộn nhẹ. - Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
- Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C. Loại dịch nổi và làm khô cặn. - Hoà tan nhẹ sản phẩm đã làm sạch bằng 15µl Hi-Di Formamine do hãng cung cấp.
Sau đó mẫu được đưa vào các giếng của ống điện di mao quản 80cm x 50 µm chứa POP – 6TM
của hãng ABI, Mỹ. Vùng gen GLA được xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI Prism 3730 và xử lý bằng phần mềm chuyên dụng.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme α-Gal A