Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp đo khối phổ
Quá trình đo MS/MS được thực hiện trên máy đo phổ khối song song với khối thiết bị ba tứ cực Triple Quad LC/MS 6460 (Aligent) sử dụng phần mềm Agilent MassHunter Quantitative Analysis.
Trước khi đo khối phổ, mẫu được chạy sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao UPLC. Pha động gồm có dung mơi A (H2O, 0,1% acid formic) và dung môi B (50% acetonitrile, 50% methanol, 0,1% acid formic). 30 µl mẫu được tiêm tự động, tốc độ dịng chảy là 200 µl/ phút với hệ thống UPLC Agilent 1290. Một cột C18 BEH (50 mm x 2,1 mm) với các hạt 1,7 m. Nhiệt độ cột là 400
C. Tổng thời gian chạy LC – MS/MS cho 1 mẫu là 3 phút. Các thông số đo khối phổ được ghi trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các thông số trong phương pháp khối phổ
Thiết bị Triple Quad LC/MS 6460 (Aligent)
ES Source ES+
Source Temp 1500C
CAD Gas 4
Curtain gas 12 psi
Gas 1 12 psi
Gas 2 42 psi
Ion Sprav Voltage 4500 V
Declustering Potential 20V
Collision Cell Exit Potential 20V
Compound MRM CE (eV) EP (V) Dwell time (mS)
GLA – IS 489.30>389.30 20 7 100
Hoạt độ được tính bằng lượng sản phẩm thu được chia cho lượng máu sử dụng và thời gian ủ trừ đi hoạt độ trung bình của mẫu trống. Mẫu trống là mẫu từ phản ứng của 3,2 mm đường kính giấy khơng chứa máu, các bước tiến hành giống với mẫu DBS. Chúng ta coi như trong 3,2 mm đường kính DBS có 3,2 µl máu toàn phần. Thời gian phản ứng là 24h.
Hoạt độ enzyme được tính theo cơng thức:
Ae = {(P/IS) x [IS] x V}/(3,2 x ti)
Ae : là hoạt độ enzyme được tính theo đơn vị µmol/h/L máu tồn phần. P/IS: là tỉ lệ thu được từ dữ liệu đo MS/MS.
IS: là nồng độ của nội chuẩn tính bằng µmol/l V: là thể tích dung dịch phản ứng tính bằng µl.
ti : là thời gian ủ tính bằng giờ.