2.3.2. Các loại hóa chất và trang thiết bị
- Máy đo phổ khối song song với cụm 3 khối thiết bị tứ cực Triple Quad LC/MS 6460 (Aligent).
- Kít giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) - Máy giải trình tự ABI Prism 3730.
- Bộ điện di ngang.
- Các hoá chất, dụng cụ cần thiết.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme α-galactosidase A
2.4.1.1. Tiến hành phản ứng enzyme
Chuẩn bị đệm phản ứng
Cân 2,45g sodium acetate trihydrate hoà tan vào nước cất. Bổ sung thêm 1,46 ml glacial acetic acid
Điều chỉnh PH về 4,6 bằng acetic acid hoặc sodium hydroxide Bổ sung thêm nước cất đề đưa thể tích dung dịch lên 250 ml
Cuối cùng, trong 250ml đệm phản ứng có 0,174 mol/l acetate, PH 4.6
Chuẩn bị dung dịch phản ứng
- Cơ chất (substrate – S): (6-Benzoylamino-hexyl)-{2-[4-(3,4,5-trihydroxy-6- hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-phenylcarbamoyl]-ethyl}-carbamic acid
tert-butyl ester (C33H47N3O10)
- Nội chuẩn (internal standard – IS): (6-d5-benzoylamino-hexyl)-[2-(4- hydroxy-phenylcarbamoyl)-ethyl]-carbamic acid tert-butyl ester (C27H32N5O5D5)
(Cơ chất và nội chuẩn do Genzyme cung cấp)
- Hoà cơ chất và nội chuẩn (S/IS) theo tỉ lệ 500:1. Bổ sung 0,45ml dung dịch sodium taurocholate 120g/l vào S/IS và votex nhẹ.
- Thêm vào 14,67ml đệm, 2,88ml N-Acetylgalactosamine (GALNAc] 1mol/l và votex nhẹ ta được dung dịch phản ứng.
Bảng 2.1. Các thành phần có trong dung dịch phản ứng
Cơ chất (S) 3,33 mmol/l
Nội chuẩn (IS) 6,67 µmol/l
sodium taurocholate 3g/l
GALNAc 160 mmol/l
sodium acetate 0,142 mol/l
PH 4.6
Phản ứng enzyme
Đục 3,2 mm đường kính giấy DBS và đặt vào ống.
Cho vào ống 70 µl sodium phosphate PH 7,1. Ủ lắc 60 phút ở 37oC (875 rpm). Sau 1 h lấy mẫu ra và đem ly tâm 2000g trong 1 phút.
Lấy 10 µl dịch nổi cho vào ống đã có sẵn 15µl dung dịch phản ứng. Ủ lắc ở 37oC trong 24h (225 rpm). Dừng phản ứng bằng cách dùng 100 µl ethyl acetate (EA): Methanol (MeOH) tỷ lệ 1:1.