Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.6. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme α– GalA và
phân tích trình tự gen GLA
1.6.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme
1.6.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC
Hoạt độ enzyme α – Gal A được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao (UPLC) kết hợp với đo khối phổ song song (MS/MS) sử dụng cơ chất và nội chuẩn.
Sắc ký lỏng là quá trình tách một hỗn hợp chất trong cột sắc ký ở trạng thái lỏng, vì thế các chất phân tích mẫu cần được hồ tan trong một chất lỏng phù hợp, thường là pha động chạy sắc ký [1].
Sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao (UPLC) là phương pháp phát triển cao, tích hợp bộ khử khí chân khơng, áp suất làm việc có thể lên tới 15000 psi. UPLC cịn cải thiện rất cao về kích thước hạt gel, tốc độ rửa chiết do đó tốc độ phân tích nhanh hơn (thời gian cho một mẫu có thể chỉ cần từ 5 – 10 phút trong khi sắc ký hiệu năng cao - HPLC cần > 30 phút), tiêu tốn ít dung mơi hơn, kết quả phân tích đáng tin cậy hơn do độ nhạy và độ phân giải cao hơn [74].
1.6.1.2. Phương pháp khối phổ hai lần (MS/MS)
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó. Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hố bằng các phương pháp thích hợp. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-).
Hình 1.8. Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp đo khối phổ song song (UPLC – MS/MS) của hãng Aligent.
Hệ thống sắc ký lỏng đầu dị 3 tứ cực gồm hệ thơng sắc lỏng hiệu năng siêu cao UPLC và hệ thống đo khối phổ. Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dị MS. Tại đây diễn ra quá trình ion, ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối. Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion. Đầu dị tứ cực có độ nhạy cao được sử dụng trong phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ MS/MS, thích hợp cho phân tích vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc [74].
Những năm gần đây, phương pháp LC – MS đã được ứng dụng ngày càng nhiều trong việc sàng lọc các bệnh tích đọng các chất trong lysosome trong đó có bệnh Fabry. Phương pháp này cho kết quả chính xác cao và có nhiều ưu việt hơn
1.6.2. Phương pháp phân tích trình tự gen GLA
1.6.2.1. Phương pháp PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp nhân nhanh một đoạn ADN mong muốn trong ống nghiệm dưới sự xúc tác của enzyme ADN polymerase. Kỹ thuật tổng hợp nhân tạo ADN cũng tuân theo các nguyên tắc như tái bản ADN trong tế bào sinh vật. Theo lý thuyết sẽ cần có 3 đoạn ADN đó là: ADN khuôn cần nhân bản, ADN mồi xuôi và mồi ngược. Thêm vào đó các thành phần khác: Taq
ADN polymerase, dNTPs (ATP, TTP, CTP và GTP), dung dịch muối MgCl2 .... Dựa vào khả năng biến tính của ADN ở nhiệt độ cao (khoảng 95oC), khi đó ADN mạch kép sẽ tách thành hai mạch đơn. Khi nhiệt độ hạ xuống thấp (45 – 50oC), mồi sẽ bắt cặp vào vị trí phù hợp trên sợi ADN sợi đơn. Tiếp đó, nhiệt độ tăng lên khoảng 72oC, enzyme sẽ xúc tác phản ứng tổng hợp kéo dài sợi ADN mới từ đoạn mồi. Chu kỳ được lặp lại liên tục tạo ra số lượng lớn ADN mới. Nhờ có kĩ thuật PCR mà từ một lượng nhỏ ADN ban đầu ra thu được một lượng đủ ADN cần thiết cho các thí nghiệm về ADN [3].
1.6.2.2. Phương pháp điện di
Điện di là phương pháp thực hiện dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử mẫu tích điện trong điện trường. Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều. Một bản gel đóng vai trị là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, xanh coomassie, bạc) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di [1].
1.6.2.3. Phương pháp xác định trình tự gen [3]
Kỹ thuật giải trình tự gen chính là phương pháp xác định sự sắp xếp của các loại nucleotide trên phân tử ADN. Có hai phương pháp xác định trình tự chính là phương pháp hố học của Maxam – Gillbert (1977) và phương pháp enzyme học của Sanger.
Nguyên tắc của phương pháp Maxam – Gillbert dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử ADN cần xác định. Phân tử ADN được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở một đầu tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch ADN đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch ADN được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.
Phương pháp Sanger dựa vào sự tổng hợp enzyme ADN polymerase. Đặc trưng của phương pháp là ngồi 4 loại nucletide thơng thường cịn sử dụng thêm 4 loại ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate gồm 4 loại ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) có nhóm 3’OH được thay thế bằng H. Các ddNTP sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp vì liên kết photphodieste khơng được hình thành. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn ADN có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn ADN gốc. Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ P32 hay S35 thì sau khi điện di người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật phóng xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn ADN.
Ngày nay, phương pháp xác định trình tự gen chủ yếu được thực hiện bằng máy giải trình tự tự động. Nguyên tắc ban đầu của hai phương pháp hoá học và enzyme được cải tiến và đưa vào các thiết bị tự động hố, nhanh và chính xác hơn. Phương pháp này kết hợp với kỹ thuật PCR để tổng hợp các oligonucleotide. Trong kỹ thuật này, các ddNTP được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang, có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm. Hỗn hợp được phân tích bằng kỹ thuật điện di mao quản và hệ thống phân tích bằng phần mềm máy tính hiện đại, chính xác.