PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
3.3.4.PCR xác định gen chắn chậm rin và gen kháng virus Ty
a/. Chiết xuất DNA: Chiết xuất DNA bằng CTAB (Doyle và Doyle, 1990) có
cải tiến: nghiền 100 mg mơ lá non với 350 ộl dịch chiết (2% CTAB (w/v); 1,5 M NaCl; 100 mM Tris-HCl; 20 mM EDTA; 2 % β - mercaptoethanol) trong ống
eppendorf 1,5 ml, thêm tiếp 350 ộl dịch chiết, trộn ựều rồi ủ ở 65oC trong 1 giờ. Thêm 700 ộl dung dịch hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol theo tỷ lệ 25:24:1, ựảo trộn nhẹ 23 phút, rồi ly tâm 12000 rpm/5 phút ở 4oC, hút 400 ộl dịch lỏng phắa trên sang ống eppendorf mớị Thêm 400 ộl dung dịch Chloroform:
Isoamyl Alcohol theo tỷ lệ 24:1, ựảo trộn nhẹ 23 phút, ly tâm 12000 rpm/5 phút ở 4oC, hút dịch lỏng phắa trên sang ống eppendorf mớị Thêm 2,5 lần thể thể tắch ethanol 100% (lạnh) ựể tủa DNA, ly tâm thu tủa ở 4oC, 12000 rpm/5 phút. Rửa tủa bằng ethanol 70% rồi để khơ tự nhiên. Hịa tan DNA trong 50 ộl đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0), bảo quản ADN ở 0oC sử dụng cho phản ứng PCR.
b/. Trình tự mồi PCR
+ Gen chắn chậm rin ựược phát hiện bằng cặp mồi rinF/R(Xiaoli, 2010): F-5Ỗ - TTA AGT TGC GAA GAA CTT GGT GTT ACC TT - 3Ỗ
R:5Ỗ - GCC AAA ACA CTT CAA TTT CCT TTA AAA GTT - 3Ỗ
+ Gen Ty3 ựược phát hiện bằng cặp mồi P6-25 F2/R5: P6-25-F2 (Ji và cộng sự, 2007c):
F2: 5Ỗ- GGT AGT GGA AAT GAT GCT GCT C - 3Ỗ;
R5: 5Ỗ- GCT CTG CCT ATT GTC CCA TAT ATA ACC - 3Ỗ
c/. Thành phần phản ứng PCR: Phản ứng PCR ựược tiến hành trong tổng thể
tắch 25 ộl, gồm: 5ộl PCR buffer (5X), 3ộl MgCl2 (25mM), 0,2ộl dNTPs (10 mM), 1,25ộl mỗi mồi (10 ộM), 0,1ộl KAPATaq HotStart DNA Polymerase (5 U/ộl) , 1ộl DNA mẫu và thêm nước cất ựến ựủ 25 ộl.
d/. Chu kỳ nhiệt
Ờ Gen rin: 94ồC/4 phút; 35 chu kỳ gồm 94ồC/30 giây, 53ồC/1 phút, 72ồC/1
phút, và kết thúc ở 72ồC/10 phút.
Ờ Gen Ty3: 35 chu kỳ gồm 94oC/30 s, 53oC/1 phút và 72oC/1 phút. kết thúc bằng bước kéo dài ở 72oC/10 phút.
e/. điện di phát hiện sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR ựược ựiện di trên gel agarose 1,5 % với hiệu ựiện thế 4 Vol/cm, sau đó nhuộm ethidiumbromide, phát quang và chụp ảnh trong buồng UV.