PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ựánh giá các tổ hợp lai vụ đơng
4.2. Kết quả PCR xác ựịnh các tổ hợp la
Trong q trình ghép cặp lai, có thể vì một lý do kỹ thuật nào ựó như sự lẫn hạt phấn trong thao tác lấy phấn từ cây bố hay do sai sót trong kỹ thuật khử đực mà con lai F1 tạo ra không phải là tổ hợp lai thật. điều này dẫn ựến tốn công sức và chi phắ để đánh giá các tổ hợp lai giả nàỵ Thêm nữa, nếu sai sót do kỹ thuật khử đực thì cây con tạo ra sẽ giống hệt dòng mẹ do sự tự thụ phấn, với các tổ hợp lai giả dạng này có thể sử dụng phương pháp so sánh kiểu hình với dịng mẹ ựể xác ựịnh. Tuy nhiên, phương pháp này địi hỏi phải trồng dịng mẹ làm đối chứng, do đó tốn cơng sức và chi phắ hơn. Nếu sự lai giả xảy ra do lẫn hạt phấn của dòng bố khác thì việc so sánh với kiểu hình dịng mẹ khơng thể xác định được. Việc sử dụng chỉ thị phân tử PCR liên kết với gen mục tiêu (Ty3 và rin) ựể xác ựịnh con lai là một phương pháp hiệu quả ựể loại bỏ sớm các tổ hợp lai giả, giúp tiết kiệm chi phắ và công sức, trong khi thao tác thực hiện lại tương ựối ựơn giản.
để xác ựịnh các tổ hợp lai, chúng tôi tiến hành thu mẫu lá ở cây con 20 ngày tuổi của mỗi tổ hợp lai, tiến hành tách DNA theo phương pháp CTAB có cải tiến. Các mẫu DNA thuộc các tổ hợp lai kháng virus ựược sử dụng ựể tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệu P6-25 F2/R5 phát hiện gen Ty3 (Ji và cộng sự,
2007a). Cặp mồi này cho sản phẩm là một vạch băng DNA có kắch thước 630 bp đối với dịng bố 192 (Ty3/Ty3), một vạch băng khoảng 320bp với các dòng mẹ mẫn cảm (ty3/ty3). đối với các tổ hợp lai thật kháng virus, do mang kiểu gen Ty3a/ty3
nên sản phẩm PCR gồm một vạch băng 630 bp và một vạch 320 bp, các tổ hợp lai giả chỉ cho một vạch 320 bp.
Kết quả PCR trên các tổ hợp lai kháng virus cho thấy tất cả các tổ hợp này ựều có sản phẩm là 2 vạch DNA sáng rõ với kắch thước 630 bp và 320 bp, tương ứng với kiểu gen Ty3/ty3 (hình 4.5). Kết quả này cho thấy tất cả tổ hợp lai kháng
virus sử dụng dòng bố 192 mang kiểu gen Ty3/Ty3 ựều là các tổ hợp lai thật. Các tổ hợp này ựược trồng và sử dụng làm vật liệu trong các nghiên cứu tiếp theọ
Hình 4.5. Kết quả PCR xác định các tổ hợp lai kháng virus sử dụng cặp mồi P6-25 F2/R5 phát hiện gen Ty3
Lađer: GeneRuler 1 kb DNA Lađer 250 to 10000 bp; các giếng khác: các tổ hợp lai tương ứng
đối với 8 tổ hợp cà chua chắn chậm, sử dụng cặp mồi ựặc hiệu rinF/R (Z.
Xiaoli, 2010) để phát hiện gen chắn chậm rin trong các tổ hợp laị đây là một chỉ thị trội nên sản phẩm PCR chỉ cho một đoạn DNA có kắch thước 850 bp ở các giống có gen rin, trong khi các giống khơng có gen rin khơng cho sản phẩm khuếch đại (Z. Xiaoli, 2010). Ở 8 tổ hợp lai chắn chậm sử dụng gen chắn chậm rin từ dòng bố 176, kết quả PCR (hình 4.6) cho thấy chỉ có 1 tổ hợp khơng cho sản phẩm khuếch ựại là RT4, các tổ hợp cịn lại đều cho một vạch băng rõ nét với kắch thước 850 bp. Như vậy, chúng tơi đã xác định và loại bỏ 1 tổ hợp lai RT4.
Hình 4.6. Kết quả PCR phát hiện các tổ hợp lai chắn chậm thơng qua sự có mặt của gen chắn chậm rin