V i k t qu hƠm l ng polyphenol Hình 3.4 M c 3.4.1, d a trên k t qu Hình 3.9, tr u cho kh n ng kháng oxy hóa t t nh t v i giá tr IC50 = 4.46 g/mL và cao
h n ch ng d ng vitamin C g p 1.3 l n. Bên c nh đó, ng i c u c ng cho kh n ng
b t g c t do (IC50 = 5.59g/mL) t ng đ ng v i ch ng d ng.Các đ i t ng còn l i nh i, m n và trà xanh cho ho t tính m nh và khơng có s chênh l ch đáng k v giá tr IC50 (t 16-25 g/mL). Kh n ng kháng oxy hóa c a tía tơ là th p nh t và th p
h n kho ng 6.4 l n so v i vitamin C. i u này phù h p v i k t qu hƠm l ng polyphenol Hình 3.4 và tannin Hình 3.5 trong lá tía tơ là th p nh t. Qua đó c ng
góp ph n ch ng minh vai trò c a hƠm l ng polyphenol và tannin v i kh n ng kháng
oxy hóa.
T các k t qu nghiên c u hai bi u đ Hình 3.8 và Hình 3.9, lá i cho ho t tính c ch enzyme tyrosinase cao nh t, sau đó lƠ lá m n có giá tr IC50 t ng đ ng v i lá i. Trà xanh cho ho t tính tr ng da th p kho ng h n 2 l n so v i lá i nh ng
nhìn chung v n đ c xem là có kh n ng lƠm tr ng da m t cách t ng đ i. V kh
n ng b t g c t do, t t c sáu đ i t ng đ u cho kh n ng kháng DPPH cao vƠ khơng có s ch nh l ch đáng k v giá tr IC50. Do đó, b c ti p theo s ti n hành k t h p
24.99 4.46 38.14 6.64 22.25 16.51 5.94 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
i Tr u Tía tơ Ng i c u M n Trà xanh Vit C
IC 50 ( g /m L ) i t ng nghiên c u
61
ba đ i t ng lá i, lá m n vƠ trƠ xanh theo hai tr ng h p k t h p lá và k t h p cao theo t l 1μ1. Sau đó, ti n hành th c hi n l i các thí nghi m đ nh l ng polyphenol, flavonoid, tannin và kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase đ l a ra t h p t t nh t. M u cao chi t k t h p này s đ c th c hi n các t l 1μ2; 1μ3; 2μ1; 3μ1 đ l a ra k t qu t i u nh t v kh n ng lƠm tr ng da.
3.7. K t h p các loài th c v t
Qua các k t qu nghiên c u v ho t tính c ch enzyme tyrosinase và kháng DPPH c a các đ i t ng nghiên c u thì lá i, lá m n vƠ trƠ xanh lƠ ba đ i t ng ti m
n ng cho quá trình k t h p. Ti n hành k t h p xen k 3 loài th c v t trà xanh- i. trà xanh- m n, i- m n theo hai tr ng h p k t h p lá và k t h p cao.
V k t h p lá, b t lá sau khi nghi n s đ c đo đ m vƠ đ c tr n theo t l 1:1 v kh i l ng khô. Ti n hành chi t b ng c n tuy t đ i, nhi t đ 45 ± 2oC, trong th i gian 45 phút, sau đó đi cơ quay đ thu đ c cao t ng k t h p lá c a các đ i
t ng.
V k t h p cao, cao t ng riêng l c a ba lo i th c v t s đ c đo đ m vƠ đ c cân theo t l 1:1 v kh i l ng cao khô. M u sau khi cân s đ c pha trong c n tuy t
62
3.7.1.ă nhăl ngăpolyphenolăc aăcácăcaoăchi tăk tăh p láăvƠăcaoăchi tăk tăh pă
cao
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)
Hình 3.10. Hàm l ng polyphenol c a các cao chi t k t h p lá và k t h p cao
K t qu xác đ nh hƠm l ng polyphenol (Hình 3.10) cho th y có s khác bi t gi a các cao chi t k t h p. Nhìn chung, c sáu cao chi t k t h p lá và k t h p cao
đ u cho giá tr TPE cao h n giá tr TPE c a các đ i t ng i, m n, trà xanh. Trong
đó, các t h p (4), (6), (8) sau khi k t h p có s t ng m nh hƠm l ng polyphenol kho ng 2.5 l n so v i (1), (2), (3) vƠ khơng có thay đ i đáng k v giá tr TPE. T ng
t nh các m u cao chi t k t h p lá, các k t h p cao (5), (7), (λ) c ng cho giá tr TPE r t cao so v i t ng đ i t ng riêng l và có giá tr g n ngang b ng nhau. Trong đó,
giá tr TPE c a các cao chi t k t h p lá chi m u th cao h n so v i các cao chi t k t h p cao (giá tr TPE c a m u (4) l n h n (5), m u (6) l n h n (7), m u (8) l n h n
(9)). M c dù q trình k t qu có s thay đ i v hƠm l ng polyphenol trong các m u cao chi t k t h p nh ng tùy vƠo tr ng h p k t h p mà cho ra k t qu khác nhau.
i u này có th gi i thích do s khác bi t v quy trình vƠ đi u ki n k t h p. các k t h p lá, do các loài th c v t đ c chi t ngay t ban đ u v i nhi t đ 45 ± 2oC cùng v i tác đ ng c h c c a cánh khu y nên có đ th i gian đ th c hi n các ph n ng
173.79 142.76 169.79 416.31 352.72 395.85 333.48 396.52 341.11 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 i M n Trà xanh Trà xanh
+ i (Lá) + i (Cao)Trà xanh Trà xanh+ M n (Lá) Trà xanh +M n
(Cao) i+ M n (Lá) i+ M n (Cao) H Ơm l ng (m g/ g ca o)
63
gi a các ch t trong hai loài th c v t khi k t h p. Còn k t h p cao, các ph n ng sinh ra các h p ch t m i v n x y ra nh ng do th i gian ti p xúc nhi t không lơu nh
các k t h p cao nên di n ra ít và ch m h n. Do trong trà xanh và lá i ch a hàm
l ng catechin nhi u [113-115] và lá m n ch a các aldehyde, acid…[116] nên ph n ng di n ra có th k đ n là ph n ng trùng h p c a catechin hay ph n ng gi a catechin và các andehyde t o ra các polyphenol m i. Vì v y, sau khi k t h p thì t t c các t h p đ u t ng m nh so v i t ng đ i t ng nghiên c u và nh vào s khác bi t trong quy trình k t h p đư cho k t qu các m u k t h p lá t t h n so v i các m u k t h p cao. D a vào Hình 3.10 có th d đốn ho t tính c ch enzyme tyrosinase c a các m u k t h p s t ng so v i ban đ u.
3.7.2.ă nhăl ngăflavonoid c aăcácăcaoăchi tăk tăh pláăvƠăcaoăchi tăk tăh păcao
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)
Hình 3.11. HƠm l ng flavonoid c a các cao chi t k t h p lá và k t h p cao
th Hình 3.11 th hi n hƠm l ng flavonoid c a các cao chi t k t h p. T ng
t nh polyphenol, giá tr TFE c a các cao chi t k t h p lá và k t h p cao đ u cao
h n so v i t ng đ i t ng riêng r i, m n. Tuy nhiên, c sáu t h p này cho k t qu th p h n so v i lá trƠ xanh. Nguyên nhơn lƠ do hƠm l ng flavonoid c a trà xanh l n
245.02 210.77 345.28 323.36 312.23 325.26 293.58 308.33 267.49 0 50 100 150 200 250 300 350 400 M Trà xanh T à à (Lá) T à à (Cao) Trà xanh+ M à L M à CTrà xanh+ (Lá)àM à àM à (Cao) H à à à
64
nh t và chênh l ch h n 100 mg QUE/g cao so v i hai đ i t ng nghiên c u còn l i (v i giá tr TFE là 345.28 mg QUE/g cao) nên khi k t h p trà xanh- i (4), (5) hay trà xanh- m n (6), (7) thì hƠm l ng flavonoid s t ng trong kho ng giá tr TFE gi a lá m n, lá i và trà xanh. Riêng khi k t h p hai th c v t i- m n (8), (9), m c dù giá tr
TFE ban đ u l n l t là 245.02 mg QUE/g cao và 210.77 mg QUE/g cao nh ng k t qu t h p theo t l 1:1 hai tr ng h p k t h p lá vƠ cao đ u cho hƠm l ng flavonoid t ng kho ng 1.3 l n. Nh đư trình bƠy ph n polyphenol k t h p M c 3.7.1, trong quá trình k t h p s x y ra các ph n ng t o ra các flavonoid m i. D a vào k t qu Hình 3.11, có th d đốn c sáu t h p s cho giá tr ph n tr m c ch
enzyme tyrosinase c ng nh kh n ng kháng oxy hóa cao hóa cao h n so v i t ng
đ i t ng lá i, lá m n và trƠ xanh. Trong đó, cao chi t k t h p i- m n có th s cho ho t tính v t b c h n so v i 4 t h p còn l i.
3.7.3ă nhăl ngătanninăc aăcácăcaoăchi tăk tăh p
D a trên k t qu Hình 3.12, h u h t hƠm l ng tannin trong các cao chi t k t h p lá và k t h p cao đ u khơng có s chênh l ch đáng k v i các đ i t ng nghiên c u riêng l nh lá i, lá m n và trà xanh. Các t h p lá và t h p cao t (5) đ n (9)
đ u dao đ ng trong kho ng t 126.5 mg TAE/g cao đ n 163.91 mg TAE/ g cao. Riêng m u k t h p lá trà xanh- i (4) có s t ng hƠm l ng tannin v i giá tr TTE là 204.60 mg TAE/g cao so v i 5 t h p cịn l i. Bên c nh đó, c 6 k t h p nƠy đ u cho giá tr
TTE cao h n giá tr TTE c a lá m n (119.24 mg TAE/ g cao). Vì tannin là h p ch t kháng oxy hóa r t m nh [79] nên hƠm l ng tannin t ng trong các cao chi t k t h p
đ ng ngh a v i kh n ng b t g c t do DPPH c a các cao chi t 1:1 t (5) đ n (9) s
cao h n so v i lá m n. Bên c nh đó, m u cao chi t k t h p lá trà xanh- i (4), v i
l ng tannin cao nh t trong k t qu bi u đ Hình 3.12 cùng v i giá tr TPE (Hình 3.10) có th s cho kh n ng b t g c t do t t.
65
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Hình 3.12. HƠm l ng tannin c a các cao chi t k t h p lá và k t h p cao
3.7.4.ăKh oăsátăho tătínhă căch ăenzymeătyrosinaseăc aăcácăcaoăchi tăk tăh p
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)
Hình 3.13. Kh n ng c ch enzyme tyrosinase c a các cao chi t k t h p lá và k t h p cao
144.60 119.24 161.40 204.60 163.91 154.33 141.79 141.25 126.92 0 50 100 150 200 250 i M n Trà xanh Trà xanh +
i (Lá) Trà xanh + i (Cao) Trà xanh + M n (Lá) Trà xanh + M n (Cao) i + M n (Lá)
i + M n (Cao) H Ơm l ng (m g/ g ca o) 205.41 223.53 518.23 281.95 322.35 184.87 225.48 172.07 209.70 20.33 0 100 200 300 400 500 600 i M n Trà xanh Trà xanh+
i (Lá) Trà xanh+ i (Cao) xanh+M n Trà
(Lá) Trà xanh+M n (Cao) i+M n (Lá) i+M n (Cao) Acid Kojic IC 50 ( g /m )
66
K t qu Hình 3.13 cho th y kh n ng c ch enzyme tyrosinase c a các cao chi t k t h p lá và k t h p cao so v i lá i, lá m n và trà xanh. Nhìn chung, c b n t h p (4), (5), (6), (7) có trà xanh trong q trình k t h p trên đ u cho giá tr IC50
cao h n lá trƠ xanh riêng l (IC50 = 518.23g/mL). Trong đó, các cao k t h p lá đ u cho ho t tính c ch enzyme tyrosinase cao h n kh ng 1.2 l n so v i các k t h p cao trong t h p trà xanh- i, trà xanh- m n và i- m n. Ba k t h p (4), (5) vƠ (7) đ u cho giá tr IC50 n m trong kho ng giá tr IC50 c a lá trƠ xanh vƠ hai đ i t ng nghiên c u còn l i. Riêng t h p trà xanh- m n (6) trong quá trình k t h p lá l i cho ho t tính t t
h n so v i trà xanh và lá m n (IC50 = 184.87 g/mL). T ng t t h p (6), t h p (8)
tr ng h p k t h p lá c a i- m n c ng cho ho t tính c ch enzyme tyrosinase t t nh t trong t t c các k t h p và cho giá tr IC50 = 172.07 g/mL th p h n hai đ i
t ng nghiên c u lá i và lá m n. Giá tr này th p h n ch ng d ng acid Kojic kho ng 8 l n. Vì trong lá i qua kh o sát ch a hƠm l ng catechin cao v i 4456.49 g/g
[114, 115] và trong lá m n ch a nhi u các aldehyde, acid nh betulinic aldehyde, p-
hydroxybenzaldehyde, ursolic aldehyde…[116] nên khi k t h p thông qua các đi u ki n xúc tác nh nhi t đ , t c đ khu y... ph n ng trùng h p di n ra sinh ra các ch t m i có ho t tính tr ng da. M t trong các ph n ng đ c trình bày Hình 3.14. H p ch t m i đ c hình thƠnh qua q trình polymer hóa đ c hình thành theo nghiên c u c a Joo Eun Chung và c ng s n m 2004 cho ho t tính kháng oxy hóa cao và
đ c s d ng nhi u trong công ngh th c ph m [117].
Hình 3.14. Ph n ng trùng h p gi a catechin và andehyde
Ngoài ra, ph n ng trùng h p t t ng m ch catechin s hình thành các proanthocyanidin [118]. H p ch t này r t ph bi n trong các lồi th c v t và có nhi u
67
ho t tính sinh h c đ c s d ng trong đi u tr các b nh lỦ nh kháng khu n, kháng
oxy hóa, kháng viêm…[119].
Catechin Proanthocyanidin
Hình 3.15. Ph n ng polymer hóa catechin
Nh v y, sau quá trình k t h p xen k t l 1:1 gi a ba đ i t ng lá i, lá m n
vƠ trƠ xanh trên hai ph ng th c k t h p lá và k t h p cao thì k t qu cho th y c sau t h p đ u cho ho t tính c ch enzyme tyrosinase khá t t. Trong đó, m u i- m n
tr ng h p k t h p lá cho giá tr IC50 m nh h n so v i n m t h p còn l i c ng nh
t ng đ i t ng lá i, lá m n. Vì th , đơy lƠ t h p ti m n ng đ c l a ch n đ ti p t c th c hi n chi t theo các t l còn l i nh 1μ2; 1μ3; 2μ1; 3μ1 vƠ xác đ nh l i ho t
tính đ thu đ c k t h p i- m n có t l t i u nh t trong các đ i t ng nghiên c u.
3.7.5.ăKh oăsátăho tătínhă căch ăenzymeătyrosinaseăc aăcácăcaoăchi tăk tăh pă i-
m nătheoăcácăt l
Hai loài th c v t i và m n đ c k t h p theo các t l 1:2; 1:3; 2:1; 3:1 v kh i
l ng khơ, sau đó đ c chi t b ng dung môi c n tuy t đ i th i gian và t c đ khu y thích h p. Cơ quay d ch chi t đ thu đ c cao t ng và xác d nh ho t tính c ch enzyme tyrosinase. K t qu đ c th hi n qua bi u đ c t Hình 3.16 và Ph l c 21.
68
Hình 3.16. Kh n ng c ch enzyme tyrosinase c a các cao k t h p t l
D a vào k t qu Hình 3.16, ho t tính c ch enzyme tyrosinase c a các cao chi t k t h p t l i- m n 1μ2; 2μ1; 3μ1 đ u có giá tr g n ngang b ng nhau và khơng có s chênh l ch đáng k so v i lá m n (IC50 = 172.07 g/mL). Riêng t l 1:3 và 1:1 cho giá tr IC50 th p h n hai đ i t ng nghiên c u lá i, lá m n l n l t là 190.56 g/mL và 172.07 g/mL. Nh v y, dù là k t h p hai đ i t ng nghiên c u, tuy nhiên t l k t h p gi a chúng đóng vai trị r t quan tr ng. Nh đư trình bƠy M c 3.7.1, có nhi u ph n ng di n ra gi a các ch t có trong h n h p i- m n hình thành các h p ch t m i. Các h p ch t này có th cho ho t tính c ch enzyme tyrosinase hay kháng oxy hóa. T đó, các t h p t ng ho t tính so v i các cơy ban đ u. Tuy nhiên, tùy vào t l k t h p mà các ph n ng này x y ra ít hay nhi u. Vì th , giá tr IC50 c a các t l k t h p có s khác bi t. T l 1:1 cho k t qu t t nh t. 205.41 223.53 190.56 222.11 172.07 231.57 238.19 20.33 0 50 100 150 200 250 300
i M n O-M 1:3 O-M 1:2 O-M 1:1 O-M 2:1 O-M 3:1 Acid Kojic
69
3.7.6ăKh oăsátăkh ăn ngăkhángăoxyăhóaăc aăcaoăchi tăk tăh pă i- m nă1:1
B ng 3.4. Ph n tr m c ch DPPH c a cao chi t k t h p i-m n t l 1:1
i- M nă1:1
N ngăđ ă(mg/mL) 10
I% 86.19% ± 0.71
Qua kh o sát b t g c t do DPPH theo ph ng pháp Sharma n m 200λ [88], ho t tính kháng oxy hóa c a cao chi t k t h p i- m n t l 1:1 đ t 86.19% n ng
đ 10 g/mL, t ng so v i các đ i t ng riêng nh lá i và lá m n (giá tr IC50 c a lá