CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.6. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN MÃ HÓA 16S
DNA tổng số của vi khuẩn biển được tách chiết theo phương pháp bead beating [129]. Đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại bằng máy luân nhiệt (Polymerase Chain Reaction – PCR) (Máy Techne Prime Thermal Cyclers, hãng Techne, Anh) từ DNA tổng số, sử dụng với cặp mồi 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTAG và 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT [130]. Thành phần hỗn hợp cho PCR bao gồm 25 µL đệm mastermix PCR, 2 µL mồi xi, 2 µL mồi ngược, 1 – 2 µL DNA khn và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 50 µL. Chu kì nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở 94 ℃ trong 5 phút; 35 chu kì của 94 ℃ trong 1 phút, 62 ℃ trong 1 phút và 72 ℃ trong 1 phút 30’; và cuối cùng kết thúc ở 72 ℃ trong 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %, tinh sạch, giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Sản phẩm đoạn gen 16S rRNA được so sánh với các trình tự trên Ngân hàng Gen quốc tế bằng công cụ trực tuyến Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST) tích hợp trên trang web The National Center for Biotechnology Information (NCBI) [131]. Cây phân loại được xây dựng sử dụng phần mềm MEGA X phiên bản 10.1.8 với phương pháp Neighbor joining sử dụng bootstrap 1000 [132].
2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn kháng khuẩn
Dựa vào phổ kháng khuẩn được xác định ở bước trên, 4 chủng vi khuẩn tiềm năng được lựa chọn để xác định độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn. Độ bền nhiệt là một đặc tính quan trọng nhằm đánh giá khả năng ứng dụng của hợp chất kháng khuẩn trong lĩnh vực ni trồng thủy sản. Theo đó, dịch ni cấy sau 24 giờ được ly tâm, phần dịch trong được ủ ở 60 ℃ và 80 ℃ trong vòng 60 phút, sau đó được làm lạnh nhanh. Dịch trước (đối chứng) và sau xử lý nhiệt được sử dụng để xác định hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus cịn lại bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
2.3.8. Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng
khuẩn của vi khuẩn biển
Thí nghiệm được thiết kế nhằm lựa chọn thời gian lên men tối ưu mà tại đó vi khuẩn sinh chất kháng khuẩn ở nồng độ cao nhất cho việc thu nhận và tinh sạch chất sau này. Theo đó, vi khuẩn được cấy ria từ môi trường bảo quản (–80 ℃) sang đĩa thạch LPMA, ủ ở nhiệt độ 30 ℃ qua đêm. Khuẩn lạc đơn được tăng sinh giống trong 10 ml canh trường LPMB, lắc ở nhiệt độ 30 ℃ qua đêm với tốc độ lắc 150 rpm. Khoảng 1 ml dịch ni cấy qua đêm được cấy chuyển vào bình tam giác thể tích 250 ml chứa 100 ml mơi trường LPMB (tỷ lệ cấy giống 1 %), lắc ở nhiệt độ 30 ℃ với tốc độ lắc 120 vòng/phút trong vòng 48 giờ. Định kỳ, 5 ml dịch môi trường được thu nhận mỗi 3 giờ, ở các thời gian tương ứng là 3, 6, 9, 12, 24, 27 30, 33 và 48 giờ. Mật độ tế bào trong dịch môi trường được xác định thông qua giá trị OD 600 nm. Môi trường ni cấy được ly tâm ở 4.500 vịng/phút trong 20 phút, lọc qua màng PES 0,45 µm thu lấy dịch môi trường vô khuẩn, dịch được cất giữ ở –20 ℃. Hoạt tính tiêu diệt V. parahaemolyticus và L. monocytogenes của môi trường
nuôi cấy được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính được thể hiện ở Hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính Vật liệu thí nghiệm Phân lập vi khuẩn Tuyển chọn chủng vi khuẩn đối kháng VSV chỉ thị Xác định bản chất của chất kháng khuẩn Xác định phổ kháng khuẩn Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử, nghiên cứu mối quan hệ
phát sinh loài
Kết luận
Tuyển chọn chủng VKB sinh bacteriocin
Khảo sát thời gian lên men đến khả năng
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN
19 nguồn mẫu biển đã được thu thập phục vụ cho phân lập VKB bao gồm 02 mẫu ruột tôm, 04 mẫu ruột cá, 01 mẫu rong biển và 12 mẫu bọt biển. Hình ảnh và tên một số mẫu đã được mơ tả chi tiết ở Hình 2.2. Dựa trên màu sắc, kích thước và hình thái bề mặt khuẩn lạc VKB, thí nghiệm phân lập thu nhận được 152 chủng VKB bao gồm 128 chủng trên môi trường TSA và 24 chủng trên mơi trường TCBS. Hình thái khuẩn lạc của một số đại diện vi khuẩn biển được trình bày ở Hình 3.1 với sự đa dạng về màu sắc, kích thước. VKB trên mơi trường TCBS chỉ thu được ở ruột cá, tôm biển ở mẫu gốc hoặc pha loãng 10 lần. VKB thu nhận trên TSA thường được phân lập ở độ pha loãng 100 lần hoặc 1000 lần.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn biển
Trong đó: (A) Hình thái khuẩn lạc trên mơi trường TCBS; (B) Hình thái khuẩn
lạc trên môi trường TSA.
Kết quả cho thấy các vi khuẩn biển có khuẩn lạc đa dạng về hình thái, kích thước, màu sắc khuẩn lạc.
Bảng 3.1. Thơng tin về số lượng chủng VKB được phân lập tương ứng với từng mẫu và từng môi trường
Các nội dung thông tin Bọt biển Ruột
tôm
Ruột
cá Rong
Địa điểm thu mẫu Biển
Phú Quý Biển Nha Trang Số lượng mẫu thu nhận cho phân lập
VKB 12 2 4 1
Số chủng VKB thu nhận được trên môi
trường TSA 65 18 35 10
Số chủng VKB thu nhận được trên môi
trường TCBS 0 7 17 0
Tổng số chủng VKB thu nhận được trên
cả 2 môi trường (TSA và TCBS) 65 25 52 10
Kết quả phân lập cho thấy số chủng VKB thu nhận được trên mơi trường TSA và TCBS có sự khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu. Theo đó, ở mơi trường TSA cả 4 loại mẫu đều thu được chủng vi khuẩn, nhiều nhất là ở bọt biển (65 chủng), sau đó ở ruột cá (35 chủng), ruột tơm (18 chủng) và rong biển (10 chủng). Tỷ lệ phân lập vi khuẩn cao nhất ở mẫu bọt biển có thể giải thích do: Bọt biển có cấu trúc đặc trưng gồm nhiều lỗ nhỏ, tạo điểm bám cho vi khuẩn, hỗ trợ cho sự phát triển của nhiều loài nên mật độ của vi khuẩn cao. Trong khi đó, ở mơi trường TCBS chỉ 2 mẫu ruột tôm (7 chủng), ruột cá (17 chủng) thu được vi khuẩn không ghi nhận từ mẫu bọt biển. Trong nghiên cứu này, môi trường TCBS được lựa chọn để phân lập các chủng Vibrio spp. từ mẫu nghiên cứu, kết quả cho thấy Vibrio spp. khu trú trong mẫu ruột tôm, cá nhưng không hiện diện trong các mẫu bọt biển. Chủng Vibrio spp. mơi trường thường là chủng sinh các bacteriocin có hoạt tính đối kháng mạnh với Vibrio spp., do bacteriocin là hoạt chất thường biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn tương đồng về loài với vi khuẩn sinh bacteriocin.
Số lượng chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường TSA cao hơn môi trường TCBS, do TCBS là môi trường chọn lọc hạn chế sinh trưởng của phần lớn các vi khuẩn khác ngoại trừ Vibrio spp. Trong khi đó, mơi trường TSA hỗ trợ sinh trưởng của đa số vi khuẩn từ mẫu.
3.2. TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI
VIBRIO SPP.
Từ các chủng vi khuẩn biển thu nhận được, các VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. (gọi tắt là bac+) được xác định bằng phương pháp cấy dọc sử dụng 03 vi khuẩn chỉ thị là 03 chủng Vibrio spp. khác nhau. Quá trình sàng lọc thu nhận được 30 chủng bac+ từ tổng 152 chủng VKB phân lập trên cả hai môi trường, chiếm tỷ lệ 19,7 %. Số lượng chủng VKB và số lượng chủng bac+ tương ứng với từng nguồn mẫu được đề cập chi tiết trong Bảng 3.2. So sánh với nghiên cứu khác trong cùng khu vực, tỷ lệ phân lập bac+ tương đương với nghiên cứu của Hồ Thị Hồng Nhi (20,3 %), nhưng thấp hơn tỷ lệ phân lập từ nghiên cứu của Nguyễn Văn Duy và cộng sự (29,0 %) [133, 134]. Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc những chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp.
Các nội dung thông tin Bọt biển Ruột
tôm
Ruột
cá Rong
Số bac+ phân lập được trên môi
trường TSA 9 7 10 1
Số bac+ phân lập được trên môi
trường TCBS 0 0 3 0
Tổng số bac+ phân lập được trên trên
2 môi trường 9 7 13 1
Tổng số chủng VKB thu nhận được
trên hai môi trường 65 25 52 10
Tỷ lệ số bac+ so với tổng VKB phân
lập được 13,8 % 28,0 % 25,0 % 10,0 %
Trong tổng số 128 VKB phân lập trên mơi trường TSA có 27 chủng được xác định biểu hiện hoạt tính đối kháng với ít nhất 1 vi khuẩn
Vibrio spp., chiếm tỷ lệ 21,09 %. Trong tổng số 24 VKB phân lập trên mơi trường TCBS có 03 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp., chiếm tỷ lệ 12,5 %. Xét trên tổng VKB thu nhận từ hai môi trường, tỷ lệ phân lập chủng bac+ được phát hiện theo thứ tự như sau: ruột tôm (28,0 %) > ruột cá (25,0 %) > bọt biển (13,8 %) > rong (10,0 %) (Bảng 3.2).
Kết quả chỉ ra rằng ruột tôm và cá biển là hai nguồn phân lập quan trọng để thu nhận chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. Kết quả khá tương đồng với một số nghiên cứu tương tự trên thế giới. Sugita và cộng sự [95] đã phân lập được nhiều VKB đối kháng với Vibrio spp. từ 7 lồi cá sống ở vùng biển Nhật Bản. Nhóm tác giả này cũng đã ghi nhận hoạt tính đối kháng
Vibrio spp. ở VKB phân lập từ ruột cá liệt [95]. Qua so sánh với một số nghiên
cứu khác, đa phần nguồn mẫu ban đầu dùng phân lập vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn đều dùng ruột tơm, ruột cá, các động vật thân mềm hai mảnh vỏ [96, 102, 133, 135]. Kết quả này góp phần gợi ý cho việc lựa chọn nguồn mẫu thích hợp ở những nghiên cứu tương tự về sau. Ruột các loài thủy, hải sản cung cấp môi trường sống lý tưởng cho sự phát triển và đa dạng các vi sinh vật bởi nguồn dinh dưỡng dồi dào, sự ổn định các thơng số về nhiệt độ, pH, v.v... Ngồi ra, sự hiện diện của Vibrio spp. trong ruột thủy, hải sản là tác nhân thúc đẩy sự phát triển những cơ chế đối kháng tự nhiên của hệ vi khuẩn đường ruột đối với Vibrio spp. so với mẫu bọt biển hoặc rong biển [136, 137]. Việc phân lập, nghiên cứu những chủng vi khuẩn cho hoạt tính từ ruột cá, tơm mang tính ứng dụng cao vào thực tiễn nhờ vào khả năng thích nghi tốt với mơi trường ruột trong tự nhiên giúp tạo ra các chế phẩm sinh học probiotic tương thích cao với thủy, hải sản, khả năng sản xuất bacteriocin và chất kháng khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nhưng an toàn với vật chủ ứng dụng tạo ra thuốc điều trị nhiễm khuẩn dùng trong NTTS.
Ngồi nguồn ruột cá, tơm, vi khuẩn bac+ còn được phân lập ở bọt biển, trầm tích và mẫu đất thu ở rừng ngập mặn [138, 139]. Bọt biển là một trong những nhóm sinh vật phong phú và đa dạng nhất trong hệ sinh thái biển [140].
Trong hệ sinh thái biển, bọt biển là một trong những môi trường sống phong phú nhất của các cộng đồng vi sinh vật bao gồm tảo đơn bào, virus, nấm và vi khuẩn, cho thấy sự đa dạng VSV đáng kể [141, 142]. Nhờ sự đa dạng này, bọt biển trở thành nguồn tiềm năng cho việc phân lập các chủng vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn. Nghiên cứu của Prem và cộng sự đã phân lập được 75 chủng vi khuẩn từ 4 loài bọt biển tại vịnh Mannar, 24,0 % trong tổng số chủng phân lập được cho hoạt tính kháng khuẩn [143]. Nghiên cứu của Phan Thị Hoài Trinh và cộng sự, 42,0 % (21/50 chủng) trong tổng số chủng VKB phân lập từ 23 loài bọt biển từ vùng đảo Phú Quốc có khả năng ức chế hiệu quả đối với ít nhất 2 trong 10 chủng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm [126]. Chứng tỏ bọt biển hứa hẹn là nguồn mẫu cung cấp đa dạng các lồi vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn nói riêng, hoạt tính sinh học nói chung, có tiềm năng mở rộng nghiên cứu nhằm tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới.
Ngoài bọt biển, rong biển cũng là một nguồn hứa hẹn cung cấp các vi khuẩn cho hoạt tính. Kết quả nghiên cứu ghi nhận 10,0 % trong tổng số chủng phân lập từ rong biển cho hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả này tương đồng với kết quả của một số nghiên cứu khác trên thế giới. Penesyan và cộng sự đã phân lập được 325 chủng vi khuẩn từ bề mặt hai loài rong biển Delisea pulchra và
Ulva australis, trong đó 39 chủng (chiếm 12,0 %) cho hoạt tính kháng khuẩn [144]. Thilakan và cộng sự đã phân lập được 234 chủng từ 7 lồi rong biển tại vịnh Mannar, đơng nam Ấn Độ, thu được 9,8 % trong tổng số chủng cho hoạt tính kháng khuẩn [145]. Ngồi số lượng các chủng vi khuẩn cho hoạt tính tăng dần trong các nghiên cứu, số lượng các chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ các vi khuẩn trên các loài rong biển trong giai đoạn 2000 – 2010 đã tăng gần 600 % so với thế kỷ trước [146]. Từ những dẫn chứng trên chứng tỏ rong biển là một trong những nguồn mẫu nhiều tiềm năng cần tập trung phát triển các nghiên cứu tương tự.
Nhận thấy tiềm năng đa dạng của các nguồn mẫu khác nhau, chính vì thế trong bước lựa chọn nguồn mẫu phân lập vi khuẩn, chúng tôi đã lựa chọn đa dạng các mẫu từ nhiều nguồn sinh vật biển khác nhau với mục đích nhằm đa dạng hóa kết quả, tăng khả năng phân lập được những chủng cho hoạt tính cao.
Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng của VKB đối với 3 chủng Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp cấy dọc
Trong đó: (1) V. harveyi, (2) V. parahaemolyticus, (3) V. cholerae.
Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính
đối kháng với Vibrio spp.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy hình thái khuẩn lạc của các chủng VKB được biểu hiện rõ ràng hơn trên môi trường thạch Mueller Hinton (MHA) so với mơi trường LPMA. Do đó, trong nghiên cứu này môi trường MHA được sử dụng để xác định hình thái khuẩn lạc của 30 chủng bac+. Trên môi trường MHA, sau 24 giờ ủ ở 37 ℃ trong điều kiện hiếu khí, trong tổng số 30 chủng vi khuẩn đã phân lập, khuẩn lạc của 15 chủng có màu trắng đục (chiếm 50,0 %), 07 chủng trắng ngà (23,3 %) và 5 chủng có khuẩn lạc trong (chiếm 16,7 %), 3 chủng khuẩn lạc xanh thu nhận được trên TCBS (10,0 %) (Hình 3.3 và Phụ lục 2). Khuẩn lạc của 20 chủng có dạng trịn (chiếm 66,7 %), 9 chủng có dạng răng cưa (chiếm 30,0 %), 1 chủng có dạng rìa khơng đều (chiếm 3,3%). Khuẩn lạc của 12 chủng có dạng nhầy (chiếm 40,0 %), 13 chủng có bề mặt nhăn (chiếm 43,3 %), 8 chủng bề mặt nhẵn (chiếm 26,7 %).
Có thể thấy rằng khuẩn lạc các chủng thu nhận từ bọt biển tương đối đa dạng về hình thái so với các chủng vi khuẩn thu nhận từ mẫu ruột tơm, cá. Theo đó, chủng vi khuẩn thu nhận từ nguồn ruột tôm, ruột cá đa số có khuẩn
lạc trắng đục, rìa trịn, nhầy, bề mặt nhăn hoặc có khuẩn lạc trắng trong, lớn, rìa răng cưa, khơ, bề mặt nhẵn.
Bảng 3.3. Tổng hợp về hình thái khuẩn lạc của 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. ghi nhận trên môi trường thạch Mueller Hinton
STT Mã vi khuẩn
biển Hình thái khuẩn lạc A. Chủng phân lập trên môi trường TSA
Chủng phân lập từ bọt biển
1 2002STB2.1 Khuẩn lạc trắng đục, rìa răng cưa, bề mặt nhăn 2 2002STB5.3 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa trịn, bề mặt lồi 3 2002STB19.3 Khuẩn lạc lớn, trắng trong, nhầy, rìa trịn 4 2002STB21.6 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khơ, rìa trịn, bề mặt nhăn 5 2002STB23.1 Khuẩn lạc lớn, trắng trong, nhầy, rìa trịn
6 2002STB23.2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, nhầy, bề mặt nhăn, rìa trịn, 7 2002STB23.3 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khơ, rìa trịn, bề mặt nhăn 8 2002STB29.1 Khuẩn lạc nhỏ, rìa trịn, trắng ngà, khơ, bề mặt nhăn 9 2002STB41.1 Khuẩn lạc lớn, trắng ngà, khơ, rìa răng cưa,
bề mặt nhẵn
Chủng phân lập từ ruột cá, ruột tôm và rong biển
10 2002NTCL2 Khuẩn lạc vừa, trong, rìa trịn, bề mặt lồi 11 2002NTCL3 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, bề mặt nhăn 12 2002NTCL8 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa trịn, nhầy, bề mặt nhăn 13 2002NTBD1 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, khơ,
bề mặt nhẵn
14 2002NTBD4 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, rìa răng cưa, khơ, bề mặt nhẵn
STT Mã vi khuẩn
biển Hình thái khuẩn lạc
15 2002NTBD6 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa trịn, lồi 16 2002NTST1 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, lớn, rìa răng cưa, khơ,