CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn biển
Thu mẫu: Mẫu sinh vật biển được lựa chọn là mẫu còn sống hoặc tươi, đánh bắt tự nhiên tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hịa) và biển Phú Q (Bình Thuận), vận chuyển trong ngày về phịng thí nghiệm. Mẫu được thu trong túi zip sạch và phân lập vi khuẩn ngay trong ngày. Mẫu được rửa sạch 03 lần bằng nước biển vô trùng, dùng dao mổ vơ trùng rạch phần bụng cá hoặc phần sóng lưng của tôm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sạch. Đối với rong biển và bọt biển được rửa sạch nguyên mẫu bằng nước biển vô trùng và cho vào túi zip sạch, chuyển về PTN.
Phương pháp phân lập (Hình 2.1):
Vi khuẩn biển (VKB) được phân lập theo phương pháp pha lỗng bậc 10. Theo đó, 5 g bọt biển hoặc rong biển cho vào cối tiệt trùng chứa 45 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %) và nghiền mẫu cho đến khi mẫu thành dịch huyền phù. Đối với mẫu ruột tôm và cá, 1 g mẫu ruột cho vào 9 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %), lắc ở 150 vòng/phút trong 15 phút. Đặt mẫu yên tĩnh trong cối hoặc ống nghiệm trong 10 phút, hút 1 ml dịch huyền phù cho vào 9 ml nước muối sinh lý, trộn đều mẫu và tiếp tục thực hiện pha loãng đến 10-4.
Hút 100 µL dịch ở các nồng độ pha lỗng cho vào 2 môi trường Tryptic soya agar (TSA) và Thiosulphate Citrate Bile Sucrose agar (TCBS) trước đó đã bổ sung 50 % nước biển tự nhiên, ủ ở nhiệt độ 30 ℃ trong ba ngày. Khuẩn lạc được quan sát và thu nhận mỗi ngày, làm thuần và giữ ở –80 ℃.
Từ các đĩa phân lập, các khuẩn lạc đơn của vi khuẩn lần lượt được kiểm tra độ thuần khiết bằng phương pháp cấy ria ba chiều. Theo đó, dùng que cấy vịng tiệt trùng chấm lên bề mặt khuẩn lạc, ria qua lại trên khoảng ¼ diện tích đĩa thạch. Đốt que cấy, xoay đĩa 90° ria để tạo vùng ria thứ 2 khoảng ¼ diện tích đĩa thạch. Đường ria đầu tiên cắt vào một đầu của đường ria cuối của vùng ria thứ nhất. Đốt que cấy để tiệt trùng, xoay đĩa 90° ria tương tự để tạo vùng thứ 3 và thứ 4. Sau mỗi lần cấy ria, vi sinh vật sẽ bị tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng rẽ. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại,
bao gói bằng giấy báo và ni trong tủ ấm ở 37 ℃ trong vịng 24 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy. Vi khuẩn được gọi là thuần khiết khi các khuẩn lạc trên đĩa tương đồng về hình thái, kích thước, màu sắc. Đặc điểm khuẩn lạc rời trên đĩa được mô tả dựa trên màu sắc, kích thước, hình thái, đặc điểm bề mặt và rìa của khuẩn lạc.
Các chủng vi khuẩn sau khi thuần khiết được lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Cách bảo quản như sau: ni cấy một khuẩn lạc thuần của vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường TSB đến khi mật độ quang OD600 đo được nằm trong khoảng 0,8 – 1 thì đem lưu giữ. Các chủng vi khuẩn được giữ trong các ống eppendorf 1,5 ml có bổ sung thêm 30 % glycerol. Lắc nhẹ cho đều hỗn hợp sau đó bảo quản ở –80 ℃.
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển và rong
Bọt biển, rong
Rửa sạch bằng nước biển vô trùng
5 g mẫu + 45 ml nước muối sinh lý (0,85 %)
Cá, tôm
Rửa sạch bằng nước biển vô trùng
1 g ruột + 9 ml nước muối sinh lý (0,85 %) Nghiền mẫu thành dịch huyền phù Lắc 150 vòng/phút trong 15 phút Để lắng trong 10 phút Pha lỗng 10-2, 10-3, 10-4 Hút 100 µL dịch ở các nồng độ pha lỗng vào mơi trường TSA và TCBS
Kiểm tra, quan sát, thu nhận khuẩn lạc
Ủ ở 30 ℃ trong 48 – 72 giờ
Hình 2.2. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển
Các nguồn mẫu biển thu nhận để phân lập vi khuẩn biển bao gồm: 02 mẫu tôm biển và 04 mẫu cá; (A) Tơm Tít Harpiosquilla spp., (B) Tơm He
Penaeus latisulcatus, (C) Cá Bò da Aluterus spp., (D) Cá Trác Priacanthus spp.,
(E) Cá Lượng Nhật Bản Nemipterus japonicus, (F) Cá Lạc Congresox spp. và (J) Rong nâu Sargassum spp. thu nhận tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa). (G, H, I) là hình ảnh đại diện của 03 mẫu bọt biển (trong tổng số 12 mẫu bọt biển) thu nhận tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận). Các mẫu bọt biển đang trong q trình định danh đến lồi.