CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG
VI KHUẨN
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Budu-Amoako cùng cộng sự [99] đã nghiên cứu hiệu quả tiêu diệt
Listeria monocytogenes trong các thùng chứa bảo quản tôm hùm khi kết hợp nisin và nhiệt độ. Hamza và cộng sự [100] đã nghiên cứu khả năng đối kháng của B. licheniformis với Vibrio alginolyticus và Pseudomonas gessardii bằng mơ hình in vivo trên ấu trùng Artemia salina. Kết quả cho thấy dịch môi trường nuôi cấy của B. licheniformis có hoạt tính đối kháng mạnh với hai chủng vi khuẩn gây bệnh trên, có khả năng bảo vệ, tăng khả năng sống sót của ấu trùng Artemia salina. Hiệu quả kháng khuẩn có được nhờ sự hiện diện của một protein kháng khuẩn mang tên BLDZ1 [101].
Đã có vài nghiên cứu về bacteriocin trên các nguồn mẫu thủy hải sản tươi, đông lạnh khác nhau: đã sàng lọc vi khuẩn Carnobacterium divergens
M35, được phân lập từ một mẫu trai hun khói đơng lạnh, tạo ra một bacteriocin mới, divergicin M35, thuộc nhóm IIa. Divergicin M35 nhạy cảm với proteinase-E, α-chymotrypsin và proteinase K, nhưng không nhạy cảm với trypsin và chịu được xử lý nhiệt lên đến 121 ℃ trong 30 phút. Divergicin M35 có hoạt tính kháng Listeria mạnh, đặc biệt là trên chủng Listeria monocytogenes và cũng có hoạt tính kháng vi khuẩn carnobacteria [83]; từ mẫu
tôm thẻ chân trắng Ấn Độ đã tách chiết một loại bacteriocin, phocaecin PI80, sinh tổng hợp từ chủng Streptococcus phocae PI80. Chất kháng khuẩn này nhạy cảm với trypsin, proteinase, pepsin, chymotrypsin và ức chế một số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V. fischeri [102]; đã phân lập được ba chủng vi khuẩn thuộc chi Vibrio trên hải sản tươi và đơng lạnh có hoạt tính đối kháng với các tác nhân gây bệnh
V. parahaemolyticus và V. mediterranei trên đĩa thạch. Bản chất protein của chúng được thể hiện qua sự bất hoạt bởi enzyme proteinase K [60].
Một số nghiên cứu đã tuyển chọn được nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin từ nhiều vùng sống khác nhau: đã xây dựng một bộ sưu tập gồm 57 chủng enterococcal phân lập từ các nguồn khác nhau (bao gồm nước sông, nước thải, đất, động vật và các loại rau) được sử dụng để sản xuất bacteriocin [103]. McCall và Sizemore [104] đã tuyển chọn được 795 chủng Vibrio spp. tại đảo Galveston, Texas, nhằm nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Theo nghiên cứu này khoảng 5 % chủng Vibrio spp. được phát hiện có khả năng sinh bacteriocin. Các bacteriocin này có trọng lượng phân tử cao, chỉ có khả năng kháng khuẩn đối với các chủng thuộc loài V. harveyi. Do đó, các loại bacteriocin này được gọi là harveyicin. Shehane và Sizemore [105] đã phân lập được ba chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ các cửa sông gần Wilmington (North Carolina, Mỹ), các chủng vi khuẩn này tổng hợp bacteriocin (IW1, BC1, BC2). IW1 ức chế một vài chủng của V. vulnificus; BC1 ức chế một vài chủng của
V. vulnificus, V. cholerae và V. parahaemolyticus; BC2 ức chế tất cả các chủng
Vibrio spp. Bacteriocin IW1 dễ biến tính bởi nhiệt, trong khi đó BC1 bền nhiệt
ở mức độ trung bình. BC2 rất bền nhiệt và duy trì hoạt tính của chúng khi đơng lạnh, hấp khử trùng hoặc khi xử lý ở các mức pH thấp hoặc cao.
Các nghiên cứu đã công bố hoạt tính kháng khuẩn trên các mẫu cá biển có bản chất là peptide: Sugita và cộng sự [93] đã nghiên cứu ở Vibrio spp. chủng NM 10 có hoạt tính ức chế đối với Pasteurella piscicida K-III được phân lập từ ruột của cá liệt (Leiognathus nuchalis). Vi khuẩn này tạo ra một chất kháng khuẩn một cách hiệu quả sau khi tăng trưởng ở 20 ℃ trong 24 giờ trên 1/5 PYBG agar được chuẩn bị với 50 % nước biển ở độ pH từ 7,5 đến 9,0. Các chất kháng khuẩn khơng bền nhiệt và có bản chất là protein, có khối lượng phân tử nhỏ hơn 5 kDa, có thể là một bacteriocin hoặc một chất giống như bacteriocin. Immacolata Anacarso và cộng sự [81] đã nghiên cứu ở
Lactobacillus pentosus 39 trong cá hồi tạo ra hợp chất BLIS có hoạt tính kháng
khuẩn mạnh và hoạt phổ rộng trên nhiều chủng VSV được dùng làm chỉ thị. Bindiya và cộng sự [96] đã nghiên cứu trên các dòng vi khuẩn phân lập từ ruột
Centroscyllium fabricii (cá mập biển sâu), nhóm tác giả đã sàng lọc được một
số chủng vi khuẩn sản sinh hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh bao gồm Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris,
Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus macerans và Bacillus pumilus. Phân tích trình tự gen 16S rDNA so sánh chỉ ra rằng chủng này thuộc giống Bacillus, có độ tương đồng cao (98 %) với trình tự 16S rDNA của Bacillus amyloliquefaciens. Nghiên cứu đã phân lập được 137 chất, một vài trong số chúng có khả năng kháng khuẩn. Nhóm nghiên cứu đã tách phần dịch nổi khơng có các tế bào đem thử nghiệm với dung dịch amoni sulfate và các enzyme phân giải protein. Kết quả thu được: các chất kháng khuẩn bị kết tủa bởi dung dịch amoni sulfate nồng độ từ 0 – 30 %, bị mất hoạt tính bởi các enzyme phân giải protein. Từ những kết quả trên cho thấy chất kháng khuẩn phân lập được từ vi khuẩn trong ruột cá có bản chất peptide, chính là các bacteriocin.
Wilson và cộng sự [106] đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn biển sinh chất kháng khuẩn từ một vài lồi động vật khơng xương sống ở biển (hàu, bọt biển, nhím biển, v.v...). Khi xử lý các chất kháng khuẩn này với proteinase K, các chất kháng khuẩn bị bất hoạt hồn tồn, chứng tỏ các chất này có thể có bản chất là peptide.
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
Một vài nghiên cứu trong nước cũng đã công bố tiềm năng sử dụng vi khuẩn để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra, tuy số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Nhìn chung, đa số các vi khuẩn được cơng bố thuộc chi Bacillus và xạ khuẩn. Theo đó, 2 chủng B. subtilis HY1 và L. lactis CC4K đã được nhóm tác giả Viện Cơng nghệ Sinh học cơng bố tính đối kháng với
Vibrio trong nước ni tơm [8]. Tuy nhiên, hợp chất kháng khuẩn khơng có bản chất protein, mà là các acid hữu cơ. Các chất acid hữu cơ kháng khuẩn khó áp dụng thực tế, do tác động diệt khuẩn sẽ giảm hoặc mất đi khi pha lỗng trong nước ni hoặc trong pH kiềm tính của nước ni. Nguyễn Thị Bích Đào và cộng sự [9] đã phân lập được các chủng Bacillus subtilis B1, Bacillus subtilis B2, Bacillus amyloliquefaciens B4 từ Thừa Thiên Huế. Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự [10] thu nhận 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Vibrio. Một nghiên cứu khác đã công bố hiệu quả ức chế Vibrio khi bổ sung vi khuẩn B. subtilis và
xạ khuẩn Streptomyces parvulus vào ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus
vannamei) [11].
Theo nghiên cứu của Lê Mỹ Tiểu Ngọc và cộng sự [107] đã phân lập và định danh được 4 chủng Lactococcus garvieae từ hệ tiêu hóa tơm khỏe mạnh có hoạt tính đối kháng nhóm vi khuẩn Vibrio spp., trong đó chủng L. garvieae HN09 đối kháng mạnh với nhiều loài Vibrio spp.. Ngoài ra, Nguyễn Văn Duy và cộng sự [107] đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản. Kết quả thu được của nghiên cứu này là tuyển chọn được 24 chủng có hoạt tính kháng khuẩn thuộc về nhiều chi khác nhau như Proteus, Providencia, Klebsiella, Alcaligenes, Bacillus và Enterococcus; trong số đó, bảy chủng vi khuẩn cho phổ kháng khuẩn rộng chống lại mầm bệnh từ thực phẩm và động vật, mở đường cho việc khai thác tiềm năng của chúng chế tạo thuốc mới, chế phẩm sinh học ứng dụng trong thực phẩm, chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản.
Như vậy rõ ràng việc nghiên cứu tìm kiếm và thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn biển ứng dụng trong nuôi trồng thủy hải sản tại một đất nước có vùng biển rộng lớn, đa dạng sinh học đồng thời có ngành ni trồng thủy hải sản phát triển như nước ta hiện nay là hướng nghiên cứu cần tập trung và đẩy mạnh. 1.4. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN
1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm
Bacteriocin được sử dụng rộng rãi như một chất bảo quản thực phẩm và hợp chất kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn cho động vật và người. Một ví dụ tiêu biểu là chất bảo quản thực phẩm nisin. Nisin có 3 dạng trong tự nhiên là nisin A, Z và Q [108, 109, 110]. Nisin được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua nhằm bảo vệ thực phẩm khỏi các vi khuẩn gây hư hỏng và ngộ độc [111]. Lactococcus lactis subsp. lactis KT2W2L và Lactobacillus spp. AMET1506 là hai chủng sinh nisin được sử dụng để bảo quản các sản phẩm tơm trong q trình bảo quản lạnh ở 8 ℃ hoặc nisin được tẩm vào màng thực phẩm sử dụng để kiểm soát các vi khuẩn yếm khí gây hư hỏng thực phẩm [112, 113, 114]. Lactococcus lactis subsp. lactis strain CWBI B1410 sinh ra nisin A
được sử dụng để bảo quản cá lên men truyền thống tại Senegal [115]. Ngoài ra, một bacteriocin khác từ Lactobacillus pentosus 39 cũng đã được thử nghiệm để tiêu diệt Aeromonas hydrophila ATCC 14715 và Listeria monocytogenes
trong quá trình bảo quản thực phẩm [81].
1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo vệ sức khỏe con người và
động vật trên cạn
Nghiên cứu của Claesson và cộng sự [116] đã chứng minh bacteriocin Abp 118 từ chủng Lactobacillus salivarius UCC 118 kháng lại tác nhân gây bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm (Listeria monocytogenes).
Bacteriocin được sinh ra từ vi khuẩn Gram âm có khả năng ức chế các loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột thông thường như Enterobacter, Klebsiella hoặc
Salmonella. Như chủng E. coli H22 có thể ức chế sinh trưởng của 7 chi trong họ
Enterobacteriaceae (đó là Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Salmonella, Shigella và Yersinia). Khả năng ức chế này được cho là do sự sản sinh ra microcin C7 và colicin [117].
Nghiên cứu của Carina Audisio và cộng sự [118] khi bổ sung bacteriocin sản xuất từ Enterococcus faecium J96 có khả năng kháng tác nhân gây bệnh
Salmonella pullorum và nâng cao tỷ lệ sống của gà con. Một cơng trình nghiên
cứu khác khi bổ sung colicin từ các chủng E. coli vào dạ cỏ của bò đã làm giảm số lượng tác nhân gây bệnh một cách rõ rệt như colicin E7 [119]. Microcin B17 của chủng E. coli cũng có khả năng hạn chế vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở bê con [120].
1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản
Việc ứng dụng bacteriocin như một thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản đã được thử nghiệm, tuy nhiên số lượng còn rất hạn chế. Chẳng hạn, một số vi khuẩn như Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản (động vật thân mềm, giáp xác, cá), bao gồm bổ sung trong nước nuôi và bổ sung vào thức ăn thủy sản [121, 122, 123]. Tuy nhiên, hầu hết các bacteriocin này được thu nhận từ các loài vi khuẩn trên cạn và hiệu quả diệt khuẩn không cao, chưa được tối ưu trong
môi trường nuôi trồng động vật nước mặn. Hiện nay, ngày càng nhiều các vi khuẩn biển có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản đã được phát hiện làm gia tăng tiềm năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn biển một cách hiệu quả. Có thể kể đến như sử dụng Aeromonas media A199 gia tăng hiệu quả tiêu diệt Vibrio tubiashii gây bệnh trên hàu Crassostrea gigas hoặc sử dụng Alteromonas macleodii 0444 làm tăng tỷ lệ sống của hàu thông qua khả năng tiêu diệt các nhóm vi khuẩn gây bệnh Vibrio coralliilyticus, Vibrio
pectenicida trên đối tượng nuôi trồng này [121, 124, 125]. Vì vậy, tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn biển sinh bacteriocin là rất lớn, kỳ vọng giúp ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản phát triển bền vững.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian thực nghiệm: Từ tháng 02/2020 đến 02/2021.
Địa điểm thực nghiệm: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
2.2. NGUYÊN LIỆU
2.2.1. Vật liệu thí nghiệm
Các mẫu bọt biển thu tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) ở độ sâu từ 3 – 5 m; các mẫu tôm, cá biển và mẫu rong được thu tại cảng Nha Trang (Khánh Hòa) (bản đồ vị trí thu mẫu tại Phụ lục 1) vào tháng 02/2020. Các mẫu được bảo quản lạnh (15 ℃ đến 20 ℃), vận chuyển về phịng thí nghiệm (PTN) và tiến hành phân lập vi khuẩn. Tất cả các mẫu được rửa sạch 03 lần bằng nước biển vô trùng và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển; riêng đối với các mẫu tôm và cá: dùng dao mổ vơ trùng rạch phần bụng cá hoặc phần sóng lưng của tơm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sạch và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Tryptic soy agar (TSA): Các thành phần trên một lít nước bao gồm:
Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton :3 g
NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g
Glucose: 2,5 g Nước cất: 1 L Agar: 15 g pH 7,3 ± 0,2, 25 °C
Hòa tan 45 g tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ mơi trường vào các bình tam giác, làm nút bơng và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121 °C trong vòng 15 phút.
Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB)
NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g Glucose: 2,5 g Nước cất: 1 L pH 7,3 ± 0,2, 25 °C
Hòa tan 30 g tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ mơi trường vào các bình tam giác, làm nút bơng và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121 °C trong vòng 15 phút.
Môi trường thạch nuôi cấy TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar).
Peptone special : 10 g/l Yeast extrat: 5 g/l Sodium thiosulphate: 10 g/l Sodium citrate: 10 g/l Sodium cholate: 3 g/l Oxbile (Oxgall): 5 g/l Sucrose: 20 g/l Sodium chloride 10 g/l Feric citrate: 1 g/l Brom thymol blue: 0,04 g/l Thymol blue: 0,04 g/l Agar:15 g/l
pH 8,6 ± 0,2, 25 °C
TCBS agar được sử dụng cho phân lập chọn lọc Vibrio. Thiosulfate và sodium citrate, cũng như tính kiềm của mơi trường, ức chế đáng kể sự phát triển của Enterobacteria. Mật bò và sodium cholate làm chậm sự sinh trưởng của enterococci và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương. Sự acid hóa của mơi trường từ sự lên men của sucrose bởi Vibrio khiến cho Brom thymol blue chuyển thành màu vàng. Brom thymol blue và thymol blue là chất chỉ thị pH. Sử dụng thiosulfate như là một nguồn lưu huỳnh, việc sản xuất hydrogen sulfide được phát hiện trong sự có mặt của ferric citrate. Dịch chiết nấm và peptone cung cấp nitrogen, vitamin và các amino acid trong TCBS agar. Sodium chloride cung cấp sự phát triển tối ưu và hoạt động trao đổi chất của các lồi
Hịa tan 88,1 gam của môi trường đã khử nước vào trong 1 lít nước cất hoặc nước khử ion; Đun sơi chậm, khuấy đều liên tục cho tới khi tan hoàn tồn; Khơng hấp tiệt trùng; Làm nguội tới 50 ℃ và đổ vào đĩa petri vô trùng.
Môi trường lỏng LPMB [126]:
Dịch chiết nấm men: 1,0 g/L Peptone: 5,0 g/L Dextrose: 1,0 g/L KH2PO4: 0,1 g/L
MgSO4: 0,1 g/L Nước biển tự nhiên: 500 ml/L Nước cất: 500 ml/L pH 7,0 – 7,2
Môi trường LPMA [126]:
Dịch chiết nấm men: 1,0 g/L Peptone: 5,0 g/L Dextrose: 1,0 g/L KH2PO4: 0,1 g/L
MgSO4: 0,1 g/L Nước biển tự nhiên: 500 ml/L Nước cất: 500 ml/L Agar: 17 g/L
pH 7,0 – 7,2
Môi trường Mueller Hinton agar:
Chiết thịt bò: 2,0 g/L Sản phẩn phân giải Casein bởi acid: 17,5 g/L Tinh bột: 1,5 g/L Agar: 17,0 g/L
Nước cất: 1000 ml/L pH = 7,2 – 7,6
Môi trường Mueller Hinton chứa dịch chiết thịt bò, sản phẩm phân giải Casein, Tinh bột và thạch. Chiết thịt bò và sản phẩm phân giải casein cung cấp nitơ, vitamin, carbon, amino acid, lưu huỳnh và các chất dinh dưỡng cần thiết khác. Tinh bột được bổ sung để hấp thụ bất cứ chất chuyển hóa độc nào được tạo ra. Thủy phân tinh bột tạo ra dextrose, nó sẽ cung cấp như một nguồn năng lượng. Thạch là nhân tố làm đông cứng môi trường.
2.2.3. Chủng vi sinh vật chỉ thị
Sử dụng 7 chủng vi sinh vật chỉ thị (VSVCT) gồm: 4 vi khuẩn Gram âm:
Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli;