CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG
VIBRIO SPP.
Từ các chủng vi khuẩn biển thu nhận được, các VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. (gọi tắt là bac+) được xác định bằng phương pháp cấy dọc sử dụng 03 vi khuẩn chỉ thị là 03 chủng Vibrio spp. khác nhau. Quá trình sàng lọc thu nhận được 30 chủng bac+ từ tổng 152 chủng VKB phân lập trên cả hai môi trường, chiếm tỷ lệ 19,7 %. Số lượng chủng VKB và số lượng chủng bac+ tương ứng với từng nguồn mẫu được đề cập chi tiết trong Bảng 3.2. So sánh với nghiên cứu khác trong cùng khu vực, tỷ lệ phân lập bac+ tương đương với nghiên cứu của Hồ Thị Hồng Nhi (20,3 %), nhưng thấp hơn tỷ lệ phân lập từ nghiên cứu của Nguyễn Văn Duy và cộng sự (29,0 %) [133, 134]. Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc những chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp.
Các nội dung thông tin Bọt biển Ruột
tôm
Ruột
cá Rong
Số bac+ phân lập được trên môi
trường TSA 9 7 10 1
Số bac+ phân lập được trên môi
trường TCBS 0 0 3 0
Tổng số bac+ phân lập được trên trên
2 môi trường 9 7 13 1
Tổng số chủng VKB thu nhận được
trên hai môi trường 65 25 52 10
Tỷ lệ số bac+ so với tổng VKB phân
lập được 13,8 % 28,0 % 25,0 % 10,0 %
Trong tổng số 128 VKB phân lập trên mơi trường TSA có 27 chủng được xác định biểu hiện hoạt tính đối kháng với ít nhất 1 vi khuẩn
Vibrio spp., chiếm tỷ lệ 21,09 %. Trong tổng số 24 VKB phân lập trên mơi trường TCBS có 03 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp., chiếm tỷ lệ 12,5 %. Xét trên tổng VKB thu nhận từ hai môi trường, tỷ lệ phân lập chủng bac+ được phát hiện theo thứ tự như sau: ruột tôm (28,0 %) > ruột cá (25,0 %) > bọt biển (13,8 %) > rong (10,0 %) (Bảng 3.2).
Kết quả chỉ ra rằng ruột tôm và cá biển là hai nguồn phân lập quan trọng để thu nhận chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. Kết quả khá tương đồng với một số nghiên cứu tương tự trên thế giới. Sugita và cộng sự [95] đã phân lập được nhiều VKB đối kháng với Vibrio spp. từ 7 lồi cá sống ở vùng biển Nhật Bản. Nhóm tác giả này cũng đã ghi nhận hoạt tính đối kháng
Vibrio spp. ở VKB phân lập từ ruột cá liệt [95]. Qua so sánh với một số nghiên
cứu khác, đa phần nguồn mẫu ban đầu dùng phân lập vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn đều dùng ruột tơm, ruột cá, các động vật thân mềm hai mảnh vỏ [96, 102, 133, 135]. Kết quả này góp phần gợi ý cho việc lựa chọn nguồn mẫu thích hợp ở những nghiên cứu tương tự về sau. Ruột các loài thủy, hải sản cung cấp môi trường sống lý tưởng cho sự phát triển và đa dạng các vi sinh vật bởi nguồn dinh dưỡng dồi dào, sự ổn định các thơng số về nhiệt độ, pH, v.v... Ngồi ra, sự hiện diện của Vibrio spp. trong ruột thủy, hải sản là tác nhân thúc đẩy sự phát triển những cơ chế đối kháng tự nhiên của hệ vi khuẩn đường ruột đối với Vibrio spp. so với mẫu bọt biển hoặc rong biển [136, 137]. Việc phân lập, nghiên cứu những chủng vi khuẩn cho hoạt tính từ ruột cá, tơm mang tính ứng dụng cao vào thực tiễn nhờ vào khả năng thích nghi tốt với mơi trường ruột trong tự nhiên giúp tạo ra các chế phẩm sinh học probiotic tương thích cao với thủy, hải sản, khả năng sản xuất bacteriocin và chất kháng khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nhưng an toàn với vật chủ ứng dụng tạo ra thuốc điều trị nhiễm khuẩn dùng trong NTTS.
Ngồi nguồn ruột cá, tơm, vi khuẩn bac+ còn được phân lập ở bọt biển, trầm tích và mẫu đất thu ở rừng ngập mặn [138, 139]. Bọt biển là một trong những nhóm sinh vật phong phú và đa dạng nhất trong hệ sinh thái biển [140].
Trong hệ sinh thái biển, bọt biển là một trong những môi trường sống phong phú nhất của các cộng đồng vi sinh vật bao gồm tảo đơn bào, virus, nấm và vi khuẩn, cho thấy sự đa dạng VSV đáng kể [141, 142]. Nhờ sự đa dạng này, bọt biển trở thành nguồn tiềm năng cho việc phân lập các chủng vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn. Nghiên cứu của Prem và cộng sự đã phân lập được 75 chủng vi khuẩn từ 4 loài bọt biển tại vịnh Mannar, 24,0 % trong tổng số chủng phân lập được cho hoạt tính kháng khuẩn [143]. Nghiên cứu của Phan Thị Hoài Trinh và cộng sự, 42,0 % (21/50 chủng) trong tổng số chủng VKB phân lập từ 23 loài bọt biển từ vùng đảo Phú Quốc có khả năng ức chế hiệu quả đối với ít nhất 2 trong 10 chủng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm [126]. Chứng tỏ bọt biển hứa hẹn là nguồn mẫu cung cấp đa dạng các lồi vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn nói riêng, hoạt tính sinh học nói chung, có tiềm năng mở rộng nghiên cứu nhằm tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới.
Ngoài bọt biển, rong biển cũng là một nguồn hứa hẹn cung cấp các vi khuẩn cho hoạt tính. Kết quả nghiên cứu ghi nhận 10,0 % trong tổng số chủng phân lập từ rong biển cho hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả này tương đồng với kết quả của một số nghiên cứu khác trên thế giới. Penesyan và cộng sự đã phân lập được 325 chủng vi khuẩn từ bề mặt hai loài rong biển Delisea pulchra và
Ulva australis, trong đó 39 chủng (chiếm 12,0 %) cho hoạt tính kháng khuẩn [144]. Thilakan và cộng sự đã phân lập được 234 chủng từ 7 lồi rong biển tại vịnh Mannar, đơng nam Ấn Độ, thu được 9,8 % trong tổng số chủng cho hoạt tính kháng khuẩn [145]. Ngồi số lượng các chủng vi khuẩn cho hoạt tính tăng dần trong các nghiên cứu, số lượng các chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ các vi khuẩn trên các loài rong biển trong giai đoạn 2000 – 2010 đã tăng gần 600 % so với thế kỷ trước [146]. Từ những dẫn chứng trên chứng tỏ rong biển là một trong những nguồn mẫu nhiều tiềm năng cần tập trung phát triển các nghiên cứu tương tự.
Nhận thấy tiềm năng đa dạng của các nguồn mẫu khác nhau, chính vì thế trong bước lựa chọn nguồn mẫu phân lập vi khuẩn, chúng tôi đã lựa chọn đa dạng các mẫu từ nhiều nguồn sinh vật biển khác nhau với mục đích nhằm đa dạng hóa kết quả, tăng khả năng phân lập được những chủng cho hoạt tính cao.
Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng của VKB đối với 3 chủng Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp cấy dọc
Trong đó: (1) V. harveyi, (2) V. parahaemolyticus, (3) V. cholerae.
Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính
đối kháng với Vibrio spp.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy hình thái khuẩn lạc của các chủng VKB được biểu hiện rõ ràng hơn trên môi trường thạch Mueller Hinton (MHA) so với mơi trường LPMA. Do đó, trong nghiên cứu này môi trường MHA được sử dụng để xác định hình thái khuẩn lạc của 30 chủng bac+. Trên môi trường MHA, sau 24 giờ ủ ở 37 ℃ trong điều kiện hiếu khí, trong tổng số 30 chủng vi khuẩn đã phân lập, khuẩn lạc của 15 chủng có màu trắng đục (chiếm 50,0 %), 07 chủng trắng ngà (23,3 %) và 5 chủng có khuẩn lạc trong (chiếm 16,7 %), 3 chủng khuẩn lạc xanh thu nhận được trên TCBS (10,0 %) (Hình 3.3 và Phụ lục 2). Khuẩn lạc của 20 chủng có dạng trịn (chiếm 66,7 %), 9 chủng có dạng răng cưa (chiếm 30,0 %), 1 chủng có dạng rìa khơng đều (chiếm 3,3%). Khuẩn lạc của 12 chủng có dạng nhầy (chiếm 40,0 %), 13 chủng có bề mặt nhăn (chiếm 43,3 %), 8 chủng bề mặt nhẵn (chiếm 26,7 %).
Có thể thấy rằng khuẩn lạc các chủng thu nhận từ bọt biển tương đối đa dạng về hình thái so với các chủng vi khuẩn thu nhận từ mẫu ruột tơm, cá. Theo đó, chủng vi khuẩn thu nhận từ nguồn ruột tôm, ruột cá đa số có khuẩn
lạc trắng đục, rìa trịn, nhầy, bề mặt nhăn hoặc có khuẩn lạc trắng trong, lớn, rìa răng cưa, khơ, bề mặt nhẵn.
Bảng 3.3. Tổng hợp về hình thái khuẩn lạc của 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. ghi nhận trên môi trường thạch Mueller Hinton
STT Mã vi khuẩn
biển Hình thái khuẩn lạc A. Chủng phân lập trên môi trường TSA
Chủng phân lập từ bọt biển
1 2002STB2.1 Khuẩn lạc trắng đục, rìa răng cưa, bề mặt nhăn 2 2002STB5.3 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa trịn, bề mặt lồi 3 2002STB19.3 Khuẩn lạc lớn, trắng trong, nhầy, rìa trịn 4 2002STB21.6 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khơ, rìa trịn, bề mặt nhăn 5 2002STB23.1 Khuẩn lạc lớn, trắng trong, nhầy, rìa trịn
6 2002STB23.2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, nhầy, bề mặt nhăn, rìa trịn, 7 2002STB23.3 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khơ, rìa trịn, bề mặt nhăn 8 2002STB29.1 Khuẩn lạc nhỏ, rìa trịn, trắng ngà, khơ, bề mặt nhăn 9 2002STB41.1 Khuẩn lạc lớn, trắng ngà, khơ, rìa răng cưa,
bề mặt nhẵn
Chủng phân lập từ ruột cá, ruột tôm và rong biển
10 2002NTCL2 Khuẩn lạc vừa, trong, rìa trịn, bề mặt lồi 11 2002NTCL3 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, bề mặt nhăn 12 2002NTCL8 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa trịn, nhầy, bề mặt nhăn 13 2002NTBD1 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, khơ,
bề mặt nhẵn
14 2002NTBD4 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, rìa răng cưa, khơ, bề mặt nhẵn
STT Mã vi khuẩn
biển Hình thái khuẩn lạc
15 2002NTBD6 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa trịn, lồi 16 2002NTST1 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, lớn, rìa răng cưa, khơ,
bề mặt nhẵn
17 2002NTST2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa trịn, nhầy, bề mặt nhăn 18 2002NTST5 Khuẩn lạc lớn, trong, nhầy, bề mặt nhăn, rìa trịn 19 2002NTCD2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa khơng đều, khơ,
bề mặt nhẵn
20 2002NTTB1 Khuẩn lạc lớn, trong, nhầy, bề mặt nhăn, rìa trịn 21 2002NTTB2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa răng cưa, khơ,
bề mặt nhẵn
22 2002NTTT1 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa răng cưa, khơ, bề mặt nhẵn
23 2002NTTT3 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, khơ, bề mặt nhẵn
24 2002NTTT4 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, nhầy, bề mặt nhăn, rìa trịn 25 2002NTTT6 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, nhầy, bề mặt nhăn, rìa trịn 26 2002NTTT7 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa trịn, lồi
27 2002NTR06 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khơ, rìa trịn, tâm nhăn
B. Chủng thu nhận trên môi trường TCBS
28 2002NTBD8 Khuẩn lạc vừa, xanh, rìa trịn, nhầy, bề mặt lồi 29 2002NTBD9 Khuẩn lạc vừa, xanh, rìa trịn, nhầy, bề mặt lồi,
tâm đen
30 2002NTCD10 Khuẩn lạc vừa, xanh, rìa trịn, nhầy, bề mặt lồi
Trong đó: Khuẩn lạc nhỏ: đường kính 1 – 2 mm; Khuẩn lạc vừa: đường kính
Hình 3.3. Hình thái của một số đại diện bac+ trên môi trường Mueller Hinton agar