Một vài nghiên cứu trong nước cũng đã công bố tiềm năng sử dụng vi khuẩn để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra, tuy số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Nhìn chung, đa số các vi khuẩn được công bố thuộc chi Bacillus và xạ khuẩn. Theo đó, 2 chủng B. subtilis HY1 và L. lactis CC4K
đã được nhóm tác giả Viện Công nghệ Sinh học công bố tính đối kháng với
Vibrio trong nước nuôi tôm [8]. Tuy nhiên, hợp chất kháng khuẩn không có bản chất protein, mà là các acid hữu cơ. Các chất acid hữu cơ kháng khuẩn khó áp dụng thực tế, do tác động diệt khuẩn sẽ giảm hoặc mất đi khi pha loãng trong nước nuôi hoặc trong pH kiềm tính của nước nuôi. Nguyễn Thị Bích Đào và cộng sự [9] đã phân lập được các chủng Bacillus subtilis B1, Bacillus subtilis B2, Bacillus amyloliquefaciens B4 từ Thừa Thiên Huế. Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự [10] thu nhận 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Vibrio. Một nghiên cứu khác đã công bố hiệu quả ức chế Vibrio khi bổ sung vi khuẩn B. subtilis và
xạ khuẩn Streptomyces parvulus vào ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus
vannamei) [11].
Theo nghiên cứu của Lê Mỹ Tiểu Ngọc và cộng sự [107] đã phân lập và định danh được 4 chủng Lactococcus garvieae từ hệ tiêu hóa tôm khỏe mạnh có hoạt tính đối kháng nhóm vi khuẩn Vibrio spp., trong đó chủng L. garvieae
HN09 đối kháng mạnh với nhiều loài Vibrio spp.. Ngoài ra, Nguyễn Văn Duy và cộng sự [107] đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản. Kết quả thu được của nghiên cứu này là tuyển chọn được 24 chủng có hoạt tính kháng khuẩn thuộc về nhiều chi khác nhau như Proteus, Providencia, Klebsiella, Alcaligenes, Bacillus và Enterococcus; trong số đó, bảy chủng vi khuẩn cho phổ kháng khuẩn rộng chống lại mầm bệnh từ thực phẩm và động vật, mở đường cho việc khai thác tiềm năng của chúng chế tạo thuốc mới, chế phẩm sinh học ứng dụng trong thực phẩm, chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản.
Như vậy rõ ràng việc nghiên cứu tìm kiếm và thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn biển ứng dụng trong nuôi trồng thủy hải sản tại một đất nước có vùng biển rộng lớn, đa dạng sinh học đồng thời có ngành nuôi trồng thủy hải sản phát triển như nước ta hiện nay là hướng nghiên cứu cần tập trung và đẩy mạnh. 1.4. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN
1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm
Bacteriocin được sử dụng rộng rãi như một chất bảo quản thực phẩm và hợp chất kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn cho động vật và người. Một ví dụ tiêu biểu là chất bảo quản thực phẩm nisin. Nisin có 3 dạng trong tự nhiên là nisin A, Z và Q [108, 109, 110]. Nisin được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua nhằm bảo vệ thực phẩm khỏi các vi khuẩn gây hư hỏng và ngộ độc [111]. Lactococcus lactis subsp. lactis KT2W2L và Lactobacillus spp. AMET1506 là hai chủng sinh nisin được sử dụng để bảo quản các sản phẩm tôm trong quá trình bảo quản lạnh ở 8 ℃ hoặc nisin được tẩm vào màng thực phẩm sử dụng để kiểm soát các vi khuẩn yếm khí gây hư hỏng thực phẩm [112, 113, 114]. Lactococcus lactis subsp. lactis strain CWBI B1410 sinh ra nisin A
được sử dụng để bảo quản cá lên men truyền thống tại Senegal [115]. Ngoài ra, một bacteriocin khác từ Lactobacillus pentosus 39 cũng đã được thử nghiệm để tiêu diệt Aeromonas hydrophila ATCC 14715 và Listeria monocytogenes
trong quá trình bảo quản thực phẩm [81].
1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo vệ sức khỏe con người và
động vật trên cạn
Nghiên cứu của Claesson và cộng sự [116] đã chứng minh bacteriocin Abp 118 từ chủng Lactobacillus salivarius UCC 118 kháng lại tác nhân gây bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm (Listeria monocytogenes).
Bacteriocin được sinh ra từ vi khuẩn Gram âm có khả năng ức chế các loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột thông thường như Enterobacter, Klebsiella hoặc
Salmonella. Như chủng E. coli H22 có thể ức chế sinh trưởng của 7 chi trong họ
Enterobacteriaceae (đó là Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Salmonella, Shigella và Yersinia). Khả năng ức chế này được cho là do sự sản sinh ra microcin C7 và colicin [117].
Nghiên cứu của Carina Audisio và cộng sự [118] khi bổ sung bacteriocin sản xuất từ Enterococcus faecium J96 có khả năng kháng tác nhân gây bệnh
Salmonella pullorum và nâng cao tỷ lệ sống của gà con. Một công trình nghiên
cứu khác khi bổ sung colicin từ các chủng E. coli vào dạ cỏ của bò đã làm giảm số lượng tác nhân gây bệnh một cách rõ rệt như colicin E7 [119]. Microcin B17 của chủng E. coli cũng có khả năng hạn chế vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở bê con [120].
1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản
Việc ứng dụng bacteriocin như một thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản đã được thử nghiệm, tuy nhiên số lượng còn rất hạn chế. Chẳng hạn, một số vi khuẩn như Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản (động vật thân mềm, giáp xác, cá), bao gồm bổ sung trong nước nuôi và bổ sung vào thức ăn thủy sản [121, 122, 123]. Tuy nhiên, hầu hết các bacteriocin này được thu nhận từ các loài vi khuẩn trên cạn và hiệu quả diệt khuẩn không cao, chưa được tối ưu trong
môi trường nuôi trồng động vật nước mặn. Hiện nay, ngày càng nhiều các vi khuẩn biển có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản đã được phát hiện làm gia tăng tiềm năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn biển một cách hiệu quả. Có thể kể đến như sử dụng Aeromonas media A199 gia tăng hiệu quả tiêu diệt Vibrio tubiashii gây bệnh trên hàu Crassostrea gigas hoặc sử dụng Alteromonas macleodii 0444 làm tăng tỷ lệ sống của hàu thông qua khả năng tiêu diệt các nhóm vi khuẩn gây bệnh Vibrio coralliilyticus, Vibrio
pectenicida trên đối tượng nuôi trồng này [121, 124, 125]. Vì vậy, tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn biển sinh bacteriocin là rất lớn, kỳ vọng giúp ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản phát triển bền vững.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian thực nghiệm: Từ tháng 02/2020 đến 02/2021.
Địa điểm thực nghiệm: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
2.2. NGUYÊN LIỆU
2.2.1. Vật liệu thí nghiệm
Các mẫu bọt biển thu tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) ở độ sâu từ 3 – 5 m; các mẫu tôm, cá biển và mẫu rong được thu tại cảng Nha Trang (Khánh Hòa) (bản đồ vị trí thu mẫu tại Phụ lục 1) vào tháng 02/2020. Các mẫu được bảo quản lạnh (15 ℃ đến 20 ℃), vận chuyển về phòng thí nghiệm (PTN) và tiến hành phân lập vi khuẩn. Tất cả các mẫu được rửa sạch 03 lần bằng nước biển vô trùng và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển; riêng đối với các mẫu tôm và cá: dùng dao mổ vô trùng rạch phần bụng cá hoặc phần sóng lưng của tôm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sạch và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Tryptic soy agar (TSA): Các thành phần trên một lít nước bao gồm: Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton :3 g
NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g Glucose: 2,5 g Nước cất: 1 L Agar: 15 g pH 7,3 ± 0,2, 25 °C
Hòa tan 45 g tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121 °C trong vòng 15 phút.
Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB)
NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g Glucose: 2,5 g Nước cất: 1 L pH 7,3 ± 0,2, 25 °C
Hòa tan 30 g tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121 °C trong vòng 15 phút.
Môi trường thạch nuôi cấy TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar).
Peptone special : 10 g/l Yeast extrat: 5 g/l Sodium thiosulphate: 10 g/l Sodium citrate: 10 g/l Sodium cholate: 3 g/l Oxbile (Oxgall): 5 g/l Sucrose: 20 g/l Sodium chloride 10 g/l Feric citrate: 1 g/l Brom thymol blue: 0,04 g/l Thymol blue: 0,04 g/l Agar:15 g/l
pH 8,6 ± 0,2, 25 °C
TCBS agar được sử dụng cho phân lập chọn lọc Vibrio. Thiosulfate và sodium citrate, cũng như tính kiềm của môi trường, ức chế đáng kể sự phát triển của Enterobacteria. Mật bò và sodium cholate làm chậm sự sinh trưởng của enterococci và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương. Sự acid hóa của môi trường từ sự lên men của sucrose bởi Vibrio khiến cho Brom thymol blue chuyển thành màu vàng. Brom thymol blue và thymol blue là chất chỉ thị pH. Sử dụng thiosulfate như là một nguồn lưu huỳnh, việc sản xuất hydrogen sulfide được phát hiện trong sự có mặt của ferric citrate. Dịch chiết nấm và peptone cung cấp nitrogen, vitamin và các amino acid trong TCBS agar. Sodium chloride cung cấp sự phát triển tối ưu và hoạt động trao đổi chất của các loài
Hòa tan 88,1 gam của môi trường đã khử nước vào trong 1 lít nước cất hoặc nước khử ion; Đun sôi chậm, khuấy đều liên tục cho tới khi tan hoàn toàn; Không hấp tiệt trùng; Làm nguội tới 50 ℃ và đổ vào đĩa petri vô trùng.
Môi trường lỏng LPMB [126]:
Dịch chiết nấm men: 1,0 g/L Peptone: 5,0 g/L Dextrose: 1,0 g/L KH2PO4: 0,1 g/L
MgSO4: 0,1 g/L Nước biển tự nhiên: 500 ml/L Nước cất: 500 ml/L pH 7,0 – 7,2
Môi trường LPMA [126]:
Dịch chiết nấm men: 1,0 g/L Peptone: 5,0 g/L Dextrose: 1,0 g/L KH2PO4: 0,1 g/L
MgSO4: 0,1 g/L Nước biển tự nhiên: 500 ml/L Nước cất: 500 ml/L Agar: 17 g/L
pH 7,0 – 7,2
Môi trường Mueller Hinton agar:
Chiết thịt bò: 2,0 g/L Sản phẩn phân giải Casein bởi acid: 17,5 g/L Tinh bột: 1,5 g/L Agar: 17,0 g/L
Nước cất: 1000 ml/L pH = 7,2 – 7,6
Môi trường Mueller Hinton chứa dịch chiết thịt bò, sản phẩm phân giải Casein, Tinh bột và thạch. Chiết thịt bò và sản phẩm phân giải casein cung cấp nitơ, vitamin, carbon, amino acid, lưu huỳnh và các chất dinh dưỡng cần thiết khác. Tinh bột được bổ sung để hấp thụ bất cứ chất chuyển hóa độc nào được tạo ra. Thủy phân tinh bột tạo ra dextrose, nó sẽ cung cấp như một nguồn năng lượng. Thạch là nhân tố làm đông cứng môi trường.
2.2.3. Chủng vi sinh vật chỉ thị
Sử dụng 7 chủng vi sinh vật chỉ thị (VSVCT) gồm: 4 vi khuẩn Gram âm:
Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli;
2 vi khuẩn Gram dương: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus; 1 vi nấm
(Candida albicans).
Bảng 2.1. Danh sách chủng chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm sàng lọc hoạt tính
Vi sinh vật chỉ thị Nguồn gốc Môi trường/nhiệt độ/
điều kiện tối ưu
(A) Vi khuẩn Gram dương
Bacillus cereus ATCC 10876 - TSA/30 °C/hiếu khí
Staphylococcus aureus ATCC
25923 - TSA/37 °C/hiếu khí
(B) Vi khuẩn Gram âm
Escherichia coli ATCC 25922 - TSA/37 °C/hiếu khí
Vibrio parahaemolyticus Chủng vi khuẩn gây bệnh thủy sản do Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III cung cấp TSA + 3 % NaCl/30 °C/ hiếu khí
Vibrio harveyi TSA + 3 % NaCl/30 °C/
hiếu khí
Vibrio cholerae TSA + 3 % NaCl/30 °C/
hiếu khí
(C) Nấm men
Candida albicans ATCC 10231 - MHA/30 °C/hiếu khí
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn biển
Thu mẫu: Mẫu sinh vật biển được lựa chọn là mẫu còn sống hoặc tươi, đánh bắt tự nhiên tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) và biển Phú Quý (Bình Thuận), vận chuyển trong ngày về phòng thí nghiệm. Mẫu được thu trong túi zip sạch và phân lập vi khuẩn ngay trong ngày. Mẫu được rửa sạch 03 lần bằng nước biển vô trùng, dùng dao mổ vô trùng rạch phần bụng cá hoặc phần sóng lưng của tôm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sạch. Đối với rong biển và bọt biển được rửa sạch nguyên mẫu bằng nước biển vô trùng và cho vào túi zip sạch, chuyển về PTN.
Phương pháp phân lập (Hình 2.1):
Vi khuẩn biển (VKB) được phân lập theo phương pháp pha loãng bậc 10. Theo đó, 5 g bọt biển hoặc rong biển cho vào cối tiệt trùng chứa 45 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %) và nghiền mẫu cho đến khi mẫu thành dịch huyền phù. Đối với mẫu ruột tôm và cá, 1 g mẫu ruột cho vào 9 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %), lắc ở 150 vòng/phút trong 15 phút. Đặt mẫu yên tĩnh trong cối hoặc ống nghiệm trong 10 phút, hút 1 ml dịch huyền phù cho vào 9 ml nước muối sinh lý, trộn đều mẫu và tiếp tục thực hiện pha loãng đến 10-4.
Hút 100 µL dịch ở các nồng độ pha loãng cho vào 2 môi trường Tryptic soya agar (TSA) và Thiosulphate Citrate Bile Sucrose agar (TCBS) trước đó đã bổ sung 50 % nước biển tự nhiên, ủ ở nhiệt độ 30 ℃ trong ba ngày. Khuẩn lạc được quan sát và thu nhận mỗi ngày, làm thuần và giữ ở –80 ℃.
Từ các đĩa phân lập, các khuẩn lạc đơn của vi khuẩn lần lượt được kiểm tra độ thuần khiết bằng phương pháp cấy ria ba chiều. Theo đó, dùng que cấy vòng tiệt trùng chấm lên bề mặt khuẩn lạc, ria qua lại trên khoảng ¼ diện tích đĩa thạch. Đốt que cấy, xoay đĩa 90° ria để tạo vùng ria thứ 2 khoảng ¼ diện tích đĩa thạch. Đường ria đầu tiên cắt vào một đầu của đường ria cuối của vùng ria thứ nhất. Đốt que cấy để tiệt trùng, xoay đĩa 90° ria tương tự để tạo vùng thứ 3 và thứ 4. Sau mỗi lần cấy ria, vi sinh vật sẽ bị tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng rẽ. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại,
bao gói bằng giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37 ℃ trong vòng 24 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy. Vi khuẩn được gọi là thuần khiết khi các khuẩn lạc trên đĩa tương đồng về hình thái, kích thước, màu sắc. Đặc điểm khuẩn lạc rời trên đĩa được mô tả dựa trên màu sắc, kích thước, hình thái, đặc điểm bề mặt và rìa của khuẩn lạc.
Các chủng vi khuẩn sau khi thuần khiết được lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Cách bảo quản như sau: nuôi cấy một khuẩn lạc thuần của vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường TSB đến khi mật độ quang OD600 đo được nằm trong khoảng 0,8 – 1 thì đem lưu giữ. Các chủng vi khuẩn được giữ trong các ống eppendorf 1,5 ml có bổ sung thêm 30 % glycerol. Lắc nhẹ cho đều hỗn hợp sau đó bảo quản ở –80 ℃.
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển và rong
Bọt biển, rong
Rửa sạch bằng nước biển vô trùng
5 g mẫu + 45 ml nước muối sinh lý (0,85 %)
Cá, tôm
Rửa sạch bằng nước biển vô trùng
1 g ruột + 9 ml nước muối sinh lý (0,85 %) Nghiền mẫu thành dịch huyền phù Lắc 150 vòng/phút trong 15 phút Để lắng trong 10 phút Pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 Hút 100 µL dịch ở các nồng độ pha loãng vào môi trường TSA và TCBS
Kiểm tra, quan sát, thu nhận khuẩn lạc
Ủ ở 30 ℃ trong 48 – 72 giờ
Hình 2.2. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển
Các nguồn mẫu biển thu nhận để phân lập vi khuẩn biển bao gồm: 02 mẫu tôm biển và 04 mẫu cá; (A) Tôm Tít Harpiosquilla spp., (B) Tôm He
Penaeus latisulcatus, (C) Cá Bò da Aluterus spp., (D) Cá Trác Priacanthus spp.,
(E) Cá Lượng Nhật Bản Nemipterus japonicus, (F) Cá Lạc Congresox spp. và (J) Rong nâu Sargassum spp. thu nhận tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa). (G, H, I) là hình ảnh đại diện của 03 mẫu bọt biển (trong tổng số 12 mẫu bọt biển) thu nhận tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận). Các mẫu bọt biển đang trong quá trình định danh đến loài.
2.3.2. Phương pháp khảo sát khảnăng đối kháng với Vibrio spp. của các chủng vi khuẩn biển phân lập được các chủng vi khuẩn biển phân lập được
Tìm kiếm các chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp.