CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp đánh giá độc tính của chế phẩm NC
2.2.3.1 Độc tính cấp
➢ Thiết kế thử nghiệm
Thử nghiệm xác định độc tính cấp được tiến hành theo hướng dẫn của Bộ Y tế và hướng dẫn của OECD [52].
Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng, giống cái. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phịng thí nghiệm, nhịn ăn 3 giờ trước khi thí nghiệm. Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm. Cho chuột dùng mẫu thử theo đường uống với thể tích tối đa 0,2ml/10g chuột. Số lần cho động vật uống: 1-3 lần trong 24 giờ, mỗi lần cách nhau
Bắt đầu Uống CPNC hằng ngày Uống CPNC Tiêm natri urat
4 ngày - 1 0 4 6 Thời gian
(giờ) 5
2 giờ. Sau lần cuối cùng uống mẫu thử 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại, uống nước bình thường. Theo dõi các biểu hiện của chuột trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử: theo dõi liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau khi uống chế phẩm thử lần cuối [52].
Thử nghiêm thăm dị: Tiến hành trên một số nhóm, 2 động vật thí nghiệm/ nhóm, cho uống 1 mức liều nhằm xác định khoảng liều cho thử nghiệm chính thức.
Thử nghiệm chính thức: Sau khi thử nghiệm thăm dị, động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô 10 động vật. Mỗi lô được cho uống một mức liều. Thường thiết kế thí nghiệm với lơ đầu uống liều tối đa không gây chết động vật và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết tồn bộ động vật (nếu thử nghiệm thăm dị cho thấy sản phẩm có độc tính gây chết động vật) hoặc dùng liều tăng dần đến liều tối đa mà chuột dung nạp được bằng đường uống (nếu thử nghiệm thăm dị cho thấy sản phẩm khơng gây chết động vật) [52].
➢ Theo dõi, đánh giá
- Tình trạng chung của chuột: các hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, tiết dịch, phản xạ với kích thích, phân, nước tiểu,…
- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.
- Xác định tỉ lệ động vật chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc và LD50 (nếu có). - Các động vật chết được được mổ quan sát đại thể cơ quan, phủ tạng. Nếu có dấu hiệu đáng nghi ngờ mà không xác định được rõ nguyên nhân, cần làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân.
- Theo dõi động vật 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử.
2.2.3.2. Độc tính bán trường diễn
➢ Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn với liều nhắc lại 28 ngày trên chuột cống trắng cả hai giống đực và cái theo hướng dẫn thử độc tính liều lặp lại 28 ngày qua đường uống trên động vật gặm nhấm của OECD TD-407 [53]. Chuột cống trắng mỗi giống (đực hoặc cái) được chia ngẫu nhiên thành 2 lô:
- Lơ chứng trắng: uống nước với thể tích 0,1ml/10g chuột
- Lô NC: uống chế phẩm thử liều 1980 mg/kg - liều gấp 3 lần liều cao nhất đã thử tác dụng dược lý (liều tối đa)
Chuột thí nghiệm được cho uống chế phẩm thử hoặc nước cất, mỗi lần uống với thể tích 0,1ml/10g chuột, tại cùng một thời điểm trong các ngày, liên tục trong 28 ngày. Trong suốt quá trình thử nghiệm, theo dõi tình trạng chung của chuột, hằng tuần cân để theo dõi khối lượng cơ thể đồng thời điều chỉnh lượng thuốc uống. Tại thời điểm kết thúc (sau 28 ngày uống thuốc), lấy máu tĩnh mạch đùi của từng con chuột cho vào 2 loại ống riêng: ống nghiệm có chứa dung dịch pha lỗng để làm các xét nghiệm huyết học
và ống eppendorf không chứa chất gây đông, ly tâm lấy huyết thanh để làm các xét nghiệm sinh hóa. Mổ tồn bộ chuột để quan sát đại thể các cơ quan và cân khối lượng các cơ quan, lấy ngẫu nhiên 3 chuột trong mỗi lô để làm tiêu bản vi thể gan và thận.
Quy trình xác định độc tính bán trường diễn được mơ tả như hình 2.5.
Hình 2.5. Quy trình đánh giá độc tính bán trường diễn
➢ Thơng số đánh giá
Thể trạng toàn thân: hằng ngày theo dõi các biểu hiện của động vật thực nghiệm (tình trạng da, lơng, mắt, sự tiết dịch mũi, miệng, hô hấp, phân, nước tiểu…), hoạt động tự nhiên, tư thế, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống. Hằng tuần cân động vật thực nghiệm để theo dõi sự thay đổi khối lượng cơ thể đồng thời điều chỉnh lượng thuốc uống.
Các thông số huyết học: Số lượng bạch cầu, tỷ lệ % tế bào lympho, số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng tiểu cầu.
Các thơng số hóa sinh: hoạt độ transaminase huyết thanh (ALT, AST), glucose máu, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinine huyết thanh.
Đại thể các cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận, tuyến thượng thận, lá lách; cân ngay khối lượng các cơ quan và và tính tỷ lệ so với tồn bộ cơ thể theo công thức sau:
x = 𝑚
𝑃 x 100%
Trong đó:
x: tỷ lệ khối lượng của cơ quan so với khối lượng toàn bộ cơ thể (%) m: khối lượng cơ quan (g)
P: Khối lượng cơ thể (g)
Mô bệnh học: sau khi giết động vật thực nghiệm, các mẫu gan và thận được cố định bằng dung dịch carnoy, vùi trong paraffin, cắt các lát mỏng 5-7 µm, nhuộm hematoxylin-eosin và quan sát dưới kính hiển vi quang học để đánh giá cấu trúc, hình
thái vi thể gan, thận. Các kĩ thuật làm tiêu bản và quan sát vi thể gan thận được thực hiện tại bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội.