CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm NC
2.2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm nghiên cứu trên mơ hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan
Áp dụng mơ hình gây phù bàn chân chuột thực nghiệm bằng carrageenan của Winter [68].
➢ Thiết kế thí nghiệm
Chuột được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng. - Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 330 mg/kg cân nặng. - Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 660 mg/kg cân nặng
➢ Tiến hành
Chuột được uống dung môi pha thuốc, diclofenac hoặc chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi gây viêm. Vào ngày thứ năm của thực nghiệm, tiến hành các bước như sau:
- Cho 4 lô dùng dung môi pha thuốc, thuốc chứng dương, chế phẩm thử tương ứng. - Gây viêm: sau khi uống các chế phẩm 1 giờ, tiêm carrageenan 1%, 0,1 ml/chuột
- Đo thể tích chân sau phải của chuột tại thời điểm: trước khi gây viêm (V0), sau khi gây viêm 1 giờ (V1), 3 giờ (V3), 5 giờ (V5), 7 giờ (V7).
Kỹ thuật đo được thực hiện như sau: dùng bút đánh dấu cố định mặt bên khớp gối chân sau phải của chuột, nhúng bàn chân đó vào dung dịch đo đến đúng vị trị được đánh dấu, đọc kết quả hiển thị trên thiết bị đo. Kỹ thuật đo được thực hiện bởi cùng một kỹ thuật viên theo nguyên tắc làm mù.
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như hình 2.3
Hình 2.3. Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm cấp bằng mơ hình gây phù bàn chân chuột
➢ Thông số đánh giá
- Mức độ phù bàn chân sau phải của chuột tại các thời điểm: 1, 3, 5, 7 giờ sau khi gây viêm và tính theo cơng thức:
ΔV(%) = 𝑉𝑡−𝑉0
𝑉𝑜 x 100%
Trong đó:
ΔV(%): mức độ phù bàn chân chuột tại thời điểm t sau khi gây viêm. V0: thể tích bàn chân chuột trước khi gây viêm.
Vt: thể tích bàn chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm.
Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù so với lơ chứng bệnh và được tính theo cơng thức:
- Thông số AUC mức độ phù của từng lơ. Tính tốn thơng số này theo quy tắc hình thang dựa trên mức độ phù bàn chân chuột trong toàn bộ thời gian nghiên cứu [22],
[63].
2.2.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm nghiên cứu trên mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat
Áp dụng mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat của McCarty và Faires [64].
➢ Thiết kế thí nghiệm
Chuột cống trắng khỏe mạnh, được chia ngẫu nhiên vào 4 lô, mỗi lô 9 con. - Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng. - Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 330 mg/kg cân nặng. - Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 660 mg/kg cân nặng.
➢ Tiến hành
Chuột được uống dung môi pha thuốc, diclofenac hoặc chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi gây viêm. Vào ngày thứ 3 bắt đầu chuẩn bị tạo tinh thể natri urat bằng cách hòa tan 0,4 g (0,01 mol) natri hydroxid trong 400 ml nước cất. Tiếp tục thêm 1,68 g (0,01 mol) acid uric, khuấy đều, siêu âm để acid uric hịa tan hồn tồn và để qua đêm ở nhiệt độ phịng. Sau đó, lọc hút chân khơng thu được tinh thể natri urat, rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý lạnh và sấy khô bằng tủ sấy ở 60 °C. Vào ngày thứ 5, thực nghiệm được tiến hành theo các bước sau:
- Cho 4 lô dùng dung môi pha thuốc, chứng dương, chế phẩm thử tương ứng
- Tạo hỗn dịch tinh thể natri urat: cân tinh thể natri urat khô, nghiền mịn và tạo hỗn dịch bằng nước muối sinh lý. Hỗn dịch natri urat thu được có nồng độ 48 mg/ml. - Gây viêm: 1 giờ sau khi uống các chế phẩm, tiêm 0,05 ml hỗn dịch natri urat trên
vào khớp gối chân sau trái của chuột.
- Chấm điểm đau: quan sát triệu chứng của từng động vật, đồng thời quay video ghi lại biểu hiện di chuyển của từng chuột trên mặt phẳng tại 3 thời điểm sau khi tiêm 4, 5, 6 giờ. Ba quan sát viên được thống nhất cách đánh giá điểm trước khi làm thực nghiệm chính thức và áp dụng phương pháp làm mù trong quá trình thực nghiệm. Kết quả cuối cùng được ghi nhận từ kết quả của 3 quan sát viên độc lập. Nếu có sai lệch lớn trong kết quả quan sát của 3 người, xem lại video đã ghi để đi đến đồng thuận.
Hình 2.4. Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm trên mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat
➢ Thông số đánh giá
Điểm mức độ viêm khớp chân chuột tại các thời điểm 4, 5, 6 giờ sau khi gây viêm được đánh giá dựa theo triệu chứng như bảng 2.1 dưới đây [11], [64].
Bảng 2.1. Thang điểm đánh giá mức độ viêm dựa theo triệu chứng
Triệu chứng Mô tả Điểm
Không thể hiện
rõ triệu chứng Chuột khơng có hoặc khơng thể hiện rõ biểu hiện 1 Đi khập khiễng Chuột đi tập tễnh trong tồn bộ thời gian di chuyển, chân
có khớp bị đau vẫn tham gia vào quá trình di chuyển 2 Đi bằng ba chân
không liên tục
Chân đi tập tễnh nhưng thỉnh thoảng chân có khớp bị đau khơng thể tham gia vào q trình di chuyển, phải kéo lê
hoặc co chân
3
Đi hoàn toàn bằng ba chân
Chân có khớp bị đau khơng thể tham gia vào q trình di chuyển, khơng thể cử động khớp bị viêm, phải kéo lê
hoặc co chân
4