CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric của chế phẩm NC
2.2.1.1. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nghiên cứu đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mơ hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxonat.
Áp dụng mơ hình gây tăng acid uric cấp bằng cách tiêm màng bụng kalioxonat [10], [23], [62].
➢ Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 9 con.
- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống allopurinol liều 10 mg/kg cân nặng chuột. - Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 600 mg/kg cân nặng chuột. - Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 1200 mg/kg cân nặng chuột.
➢ Tiến hành
Các lô chuột được uống các chế phẩm tương ứng với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định, hàng ngày trong 4 ngày. Vào ngày thứ năm, thực hiện các bước như sau:
- Gây tăng acid uric: tiêm màng bụng hỗn dịch kalioxonate pha trong NaCMC 0,5%, liều 500 mg/kg cân nặng vào tất cả các chuột.
- Lấy mẫu và xử lý mẫu: Sau khi tiêm kalioxonate 150 phút, lấy máu từ xoang hốc mắt chuột. Máu được để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ, sau đó đem ly tâm với tốc độ 3000 vịng/phút trong 10 phút. Sau đó lấy huyết thanh để định lượng acid uric. Trong thời gian chờ để định lượng acid uric, huyết thanh được bảo quản ở -200C. Nồng độ acid uric được xác định thông qua việc đo mật độ quang của sản phẩm phản ứng giữa acid uric và hóa chất thử ở bước sóng 520nm.
➢ Thông số đánh giá: Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm
Tác dụng hạ acid uric được đánh giá bằng tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng và tính theo cơng thức:
𝐼 (%) = 𝐶𝑐 − 𝐶𝑡
𝐶𝑐 𝑥 100 Trong đó:
CC, CT: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử.
I (%): tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng Tồn bộ quy trình thí nghiệm được tóm tắt như hình 2.2.
Hình 2.2. Quy trình đánh giá tác dụng của chế phẩm NC trên mơ hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxonat
2.2.1.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nghiên cứu đến hoạt độ của enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm.
➢ Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 9 con.
- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống allopurinol liều 10 mg/kg cân nặng chuột. - Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 600 mg/kg cân nặng chuột. - Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 1200 mg/kg cân nặng chuột.
➢ Tiến hành
Các lô chuột được uống các chế phẩm tương ứng với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định, hàng ngày trong 4 ngày. Vào ngày thứ năm, thực hiện tiêm màng bụng hỗn dịch kalioxonate pha trong NaCMC 0,5%, liều 500 mg/kg cân nặng vào tất cả các chuột. Sau 150 phút, lấy 0,4 g gan chuột đựng trong ống microtube, bảo quản ngay trong tủ lạnh -80 oC, mẫu gan này dùng để xác định hoạt độ enzym XO.
➢ Kỹ thuật chiết enzym XO trong gan và làm phản ứng enzym [10]
Pha dung dịch đệm phosphat pH 7,5 lạnh, dung dịch đệm cơ chất (xanthin, EDTA, kalioxonat).
Chuẩn bị mẫu thử, mẫu trắng:
- Mẫu thử: 2,9 ml đệm phosphat và 2,5 ml đệm cơ chất. - Mẫu trắng: 5,4 ml đệm phosphat.
Chiết enzym: Thêm 0,5 ml đệm lạnh vào ống chứa 0,4 g gan chuột, nghiền đồng thể, thêm dần đệm đến tỉ lệ gan : đệm = 1 : 5. Ly tâm lạnh ở 0 ºC với tốc độ 3000 vòng/10 phút và 10000 vòng/60 phút. Phần dịch trong thu được sau khi ly tâm là dịch enzym dùng để xác định hoạt độ. Tồn bộ các bước của thí nghiệm được thực hiện trong điều
Bắt đầu Uống CPNC hằng ngày Bỏ thức ăn Tiêm kalioxonat Uống CPNC Lấy máu hốc mắt, định lượng acid uric
4 ngày - 30 0 30 150 Thời gian
kiện lạnh (môi trường nước đá đang tan).
Làm phản ứng enzym: Ủ mẫu thử ở 37 ºC trong 15 phút. Thêm 0,1 ml enzym vừa thu được, tiếp tục ủ trong 30 phút. Hút 200 µL dịch sau phản ứng ra đĩa UV 96 giếng Costar, đo quang ở 290 nm. Song song tiến hành với mẫu trắng của từng mẫu thử.
➢ Thông số đánh giá: Mật độ quang ΔOD của acid uric
Acid uric được tạo thành theo phản ứng:
Hoạt độ xanthin oxidase được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành đo ở bước sóng 290 nm.
Tác dụng ức chế enzym XO được đánh giá bằng tỷ lệ giảm mật độ quang acid uric của lô thử so với lô chứng và được tính theo cơng thức:
I (%) = ΔODchứng− ΔODthử
ΔODchứng x 100% Trong đó:
I (%): tỷ lệ giảm mật độ quang acid uric của lô thử so với lô chứng. ΔODchứng = ODchứng – ODtrắng chứng
ΔODthử = ODthử - ODtrắng thử