Chương 2 VẬT LIỆU Ờ NỘI DUNG Ờ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2.Xác ựịnh hàm lượng polyphenol tổng số theo 14502-1-
Ớ Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng oxi hóa các hợp chất Polyphenol bằng thuốc thử Folin ـ Ciocalteu tạo ra sản phẩm màu xanh thẫm. Cường ựộ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng ựộ Polyphenol trong một phạm vi nhất ựịnh. Căn cứ vào cường ựộ màu ựo ựược trên máy so màu (máy quang phổ UVS ـ 2800) ở bước sóng λ = 765nm và ựồ thị chuẩn của acid gallic với thuốc thử này có thể xác ựịnh hàm lượng Polyphenol trong mẫu chè.
Ớ Xây dựng ựồ thị chuẩn acid Gallic
- Chuẩn bị dung dịch mẹ của Acid Gallic chuẩn:
Cân 0,110ổ0,001g acid gallic monohydrate (ngậm 1 phân tử nước) (M=188,14) cho vào bình ựịnh mức 100 ml, hoà tan với nước cất sau ựó lên thể tắch ựến vạch và khuấy ựều ta thu ựược dung dịch chuẩn có nồng ựộ khoảng 1000 ộg/ml (Dung dịch chỉ sử dụng trong ngày).
- Chuẩn bị dung dịch pha loãng của acid Gallic trong xây dựng ựồ thị chuẩn:
đồ thị chuẩn acid Gallic ựược xây dựng trong khoảng nồng ựộ từ 10 - 50 ộg/ml.
Dùng Pipette lấy các thể tắch dung dịch Acid Gallic mẹ theo bảng 1.3 (phụ lục) và cho vào bình ựịnh mức 100 ml. Sau ựó thêm nước cất tương ứng tới vạch.
Sau khi thu ựược các dung dịch pha loãng của acid Gallic 10-50 ộg/ml. Tiến hành hút 1ml dung dịch A, B, C, D, E vào ống nghiệm, thêm 5ml Folin-
Ciocalteu 10%, lắc ựều và tiếp tục thêm 4 ml Na2CO3 7.5%, lắc ựều và ựể cho
phản ứng xảy ra trong vòng 1 giờ. Cuối cùng tiến hành so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 765nm với blank bằng nước cất. Song song với các mẫu trong dãy pha loãng, tiến hành với mẫu trắng, hút 1ml nước cất rồi lên màu tương tự như các mẫu pha loãng. Kết quả so màu từ các mẫu pha loãng trừ kết quả so màu ở mẫu trắng ựược sử dụng ựể xây dựng ựồ thị chuẩn acid Gallic bằng phương pháp thống kê.
Ớ Chiết xuất Polyphenol (ựối với nguyên liệu chè tươi)
Chè tươi ựược diệt men bằng cách hấp (100oC/3phút), làm nguội và ựược
sấy chân không (75oC) ựến ựộ ẩm = 5%, sau ựó ựược nghiền ựến kắch thước 0,5 -
1mm. Cân chắnh xác 0,2 ổ 0,001 g chè cho vào ống tube hoặc ống chiết (10 ml). - Cho bình tam giác có chứa dung môi methanol 70% vào bể ổn nhiệt ở
70oC trong 30 phút.
- đặt ống tube chứa mẫu vào bể ổn nhiệt ở 70oC, ựể khoảng 1 phút rồi
cho 5 ml methanol 70% ở 70oC vào ống chiết. Sau ựó, lấy ra và khuấy trộn
trên Vortex.
- Tiếp tục nâng nhiệt ống chiết trong bề ổn nhiệt (70oC) và khuấy trộn
lại trên Vortex ở các thời ựiểm 5 và 10 phút trắch ly.
- Sau khi chiết (10 phút), dịch chiết ựược hạ xuống nhiệt ựộ phòng bằng phương pháp tự nhiên và ựược ly tâm ở tốc ựộ 3500 vòng/phút, nhiệt ựộ
25oC trong 10 phút.
- Gạn cẩn thận phần dịch trong phắa trên của ống chiết vào một ống tube khắc ựộ 10ml (hoặc bình ựịnh mức 10ml). Phần bã tiếp tục ựược chiết lại một
lần nữa với thủ tục như trên. Sau ựó dịch chiết sau ly tâm của lần chiết 2 ựược dồn với lần chiết 1 (trong bình ựịch mức10 ml) và dùng methanol 70% ở nhiệt ựộ thường lên thể tắch tới vạch. (Dịch chiết này có thể ổn ựịnh trong 24h nếu
bảo quản ở 4oC). Tuy nhiên trước khi pha loãng ựể xác ựịnh Polyphenol, phải
ựể dịch chiết ựạt ựến nhiệt ựộ phòng.
Ớ Chiết polyphenol từ dịch ép
- Cho bình tam giác có chứa dung môi methanol (theo tỷ lệ 35ml +
11ml nước cất) vào bể ổn nhiệt ở 70oC trong 30 phút. Hút 5ml dịch chè vào
ống tube ựể vào bể ổn nhiệt ở 70oC trong 2 phút.
- Cho hỗn hợp 5ml dịch chè và dung dịch methanol vào bình tam giác ựem khuấy trộn trên Vortex.
- Tiếp tục nâng nhiệt ống chiết trong bể ổn nhiệt (70oC) và khuấy trộn
lại trên Vortex ở các thời ựiểm 5 và 10 phút trắch ly.
- Sau khi chiết (10 phút), dịch chiết ựược hạ xuống nhiệt ựộ phòng bằng phương pháp tự nhiên và ựược ly tâm ở tốc ựộ 3500 vòng/phút, nhiệt ựộ
25oC trong 10 phút.
- Gạn cẩn thận phần dịch trong phắa trên của ống chiết vào một ống tube khắc ựộ 50ml (hoặc bình ựịnh mức 50ml). Phần bã tiếp tục ựược chiết lại một lần nữa với thủ tục như trên. Sau ựó dịch chiết sau ly tâm của lần chiết 2 ựược dồn với lần chiết 1 (trong bình ựịch mức 50ml) và dùng methanol 70% ở nhiệt ựộ thường lên thể tắch tới vạch ( dịch chiết này có thể ổn ựịnh trong 24h nếu
bảo quản ở 4oC). Tuy nhiên trước khi pha loãng ựể xác ựịnh Polyphenol, phải
ựể dịch chiết ựạt ựến nhiệt ựộ phòng.
●Xác ựịnh hàm lượng Polyphenol tổng số:
Pha loãng dịch chiết 100 lần bằng cách hút chắnh xác 1ml dịch chiết vào bình ựịnh mức 100ml và lên nước cất 2 lần ựến vạch, lắc ựều thu ựược dịch pha loãng. Tiến hành lên màu với trình tự hút 1ml dịch chiết thêm vào 5ml thuốc thử Folin - Ciocalteu 10% lắc ựều, tiếp tục thêm 4ml dung dịch
Na2CO3 7,5% lắc ựều và ựể trong 1 giờ rồi tiến hành so màu ở bước sóng 765nm. Mỗi thắ nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.
● Tắnh kết quả:
Hàm lượng Polyphenol tổng số (WT, % CK) ựược tắnh theo công thức:
(Dsample - Dintercept) x Vsample x d x 100 WT =
Sstd x msample x 10.000 x WDM,sample Trong ựó:
Dsample: mật ựộ quang thu ựược của dung dịch mẫu Dintercept: mật ựộ quang khi x bằng 0
Sstd: giá trị hệ số góc (a)
msample: khối lượng mẫu phân tắch (g) Vsample: thể tắch dịch chiết (ml) (10 ml) d: hệ số pha loãng (100)
WDM,sample: hàm lượng chất khô của mẫu phân tắch