2. Sự hình thành blastocyst:
CHƯƠNG 8: NGÂN HÀNG GENE VÀ THỊ TRƯỜNG TẾ BÀO MÔ ĐỘNG VẬT Câu 1: Các loại ngân hàng tế bào và nêu quy trình chung cho việc thiết lập ngân hàng tế
Câu 1: Các loại ngân hàng tế bào và nêu quy trình chung cho việc thiết lập ngân hàng tế bào?
Ngân hàng các tế bào được chia thành 2 loại: Ngân hàng tế bào đầu dòng ( master cell bank- MCB) và ngân hàng tế bào làm việc (working cell bank- WCB)
• Ngân hàng MCB chỉ bảo quản, lưu trữ các tế bào đầu dòng, không dùng để sản xuất hay buôn bán. Các tế bào này được sử dụng để sau đó tạo ngân hàng WCB
• Ngân hàng WCB chứa một số lượng lớn các tế bào( các quy trình tăng sinh) để cung cấp cho khách hàng.
Dù là ngân hàng nào đi nữa, thì tế bào trong lưu trữ phải tinh sạch và chuẩn, không bị nhiễm bởi bất kì các tác nhân nào. Ngoài ra các tế bào phải duy trì được khả năng sinh trưởng, phát triển và biểu hiện được tiềm năng sinh học của nó.
Kích thước của một ngân hàng tế bào phụ thuộc vào quy mô hoạt động, tần số sử dụng và khả năng tăng sinh của dòng tế bào
• Một MCB có thể chứa từ 20-50 ampoule
• Một WCB chứa chừng 100-200 ampoule Quy trình chung cho việc thiết lập ngân hàng tế bào: Dòng TB mới (được thao tác dưới điều kiện chuẩn)
Thất bại Thành công
Bỏ quy trình Giải đông 1 ampoule và nuôi cấy tăng sinh
Bảo quản đông lạnh ngân hàng MBC (10-100 ampoule)
Xét nghiệm kiểm soát chất lượng:
- Số lượng và sức sống
- Xét nghiệm vsv kể cả mycoplasma
- Chứng nhận
Thiết lập lại ngân hàng Giải đông 1 ampoule và nuôi cấy tăng sinh Đông lạnh ngân hàng WBC (20-200 ampoule)
Xét nghiệm kiểm soát chất lượng: - Số lượng và sức sống
- Xét nghiệm vsv kể cả mycoplasma - Chứng nhận
Lập lại ngân hàng để có thể sử dụng lại Đưa vào sử dụng
Các dòng tế bào mới phải đảm bảo chất lượng, được cung cấp từ các trung tâm chuyên môn như ECACC
Các dòng tế bào mới khi được thiết lập sẽ được chứng nhận bằng các phương pháp như phân tích isoenzyme, DNA finger printing, multi locus DNA finger printing và Multiplex- PCR (STR) DNA profiling
Đông lạnh tế bào trong thiệt lập ngân hàng tế bào:
• Mục đích của lưu trữ được các tế bào, phục vụ cho cung cấp hay sử dụng mỗi khi cần thiết, đặc biệt rất quan trọng khi các dòng tế bào có thời gian phân chia giới hạn khi nuôi cấy
• Giảm nguy cơ nhiễm vsv
• Giảm nguy cơ nhiễm chéo các dòng tế bào khác
• Giảm được các biến đổi về hình thái và đặc tính di truyền
• Giảm chi phí duy trì dòng tế bào
Để có thể tham gia đông lạnh và giải dòng thành công các dòng tế bào khác, nguyên lý cơ bản là đông lạnh chậm và giải đông nhanh
TB nuôi cấy khỏe mạnh với sức sống > 90% và không có dấu hiệu nhiễm vsv, kể cả nhiễm các tế bào khác, TB nên ở phase tăng trưởng log
Nên sủ dụng nồng độ huyết thanh / protein cao (>20%)
Sử dụng các chất bảo quản đông lạnh như DMSO (dimethyl sulpho xide) hay glycerol
Bảo quản ở nhiệt độ siêu thấp các dòng tế bào: Các dòng TB được đông lạnh ở trạng thái huyền phù trong một thời gian không hạn định, nếu chúng ở nhiệt độ thấp hơn -1350C. Ở nhiệt độ siêu lạnh có thể duy trì bởi các thiết bị đông lạnh điện đăc biệt hay nhúng chìm trong ni tơ lỏng hoặc phase hơi ni tơ lỏng
Câu 2: Trình bày về ngân hàng tinh trùng? Tại sao phải lập ngân hàng tinh trùng?
Một nhóm các bệnh nhân cần thiết phải tiến hành đông lạnh tinh trùng là:
Những người mắc bệnh, cần được điều trị bằng phương pháp hóa trị hay xạ trị
Những người thắt ống dẫn tinh để sinh sản có kế hoạch
Những người cân phải giải phẫu các vùng gần với xương chậu với nguy cơ cao nhất khả tinh năng xuất tinh sau đó
Những người có khả năng lượng tinh trùng biến động mạnh theo thời gian, có thể đạt tới mức không tinh trùng
Những người cần phẫu thuật để thu nhận tinh trùng từ mào tinh, hay ống dẫn tinh, họ muốn có con thông qua kĩ thuật hỗ trợ sinh sản
Quy trình đông lạnh:
Phân tích tinh dịch để xác định lượng tinh trùng và quan sát độ di động của tinh trùng
Mẫu tinh dịch được đặt vào trong các cọng rạ hay các ống thủy tinh
Trộn tinh dịch vào chất bảo quản đông lạnh. Ống ( cọng rạ) chứa tinh được hạ nhiệt độ theo các quy trình đã cài sẵn, sau đó cho vào ni tơ lỏng (-1960C)
Nếu chất lượng tinh khi xuất tinh bình thường thì lượng tinh đông lạnh sau giải đông có thể được sử dụng chừng 1-3 lần mang thai bằng kĩ thuật dẫn tinh vào tử cung. Nếu chất lượng tinh trùng kém, người ta có thể sử dụng các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản khác như IVF, ICSI
Có thể bảo quản tinh trùng an toàn lên đến 10 năm
Ngân hàng máu là nơi lưu trữ máu hay các thành phần của máu, được thu gom qua hiến máu sau đố lưu trữ, bảo quản phục vụ cho việc truyền máu.
Ngân hàng máu được thiết lập đầu tiên vào năm 1915, khi Kichard lewison bắt đầu sử dụng dung dịch sodium citrate để chống đông
Oswald Hope Robert son- một nhà nghiên cứu y khoa đã thiết lập những kho máu và bây giờ được xem là người sáng tạo ra ngân hàng máu đầu tiên
Năm 1942- 1943; J. F. Loutit và Patrick L. Mollison đưa ra dung dịch chống đông máu khác là acid citrate dextrose (ACD)
Năm 1979; chất chống đông CPDA-1 được đưa ra để kéo dài thời gian sống của máu lưu trữ
Ngân hàng máu cuống rốn: Máu cuống rốn chứa các tế bào gốc tạo máu, đây là những tế bào tiền thân, chúng sẽ hình thành các dòng tế bào hồng cầu, bạch cầu và các tiểu cầu
Quá trình thu nhận máu
Người ta có thể thu nhận máu cuống rốn của sản phụ theo một trong hai cách khác nhau: trong tử cung (in vitro) hay ngoài tử cung (ex vitro), lúc đứa bé đã ra đời.
- Máu được thu nhận ở ngoài tử cung:
• Sau khi nhau thai đã được đưa ra khỏi cơ thể mẹ và cuống rốn được cắt rời khỏi cơ thể trẻ sơ sinh
• Bánh nhau cùng cuống rốn được đặt vào dụng cụ chứa vô trùng và máu được thu nhận
• Thể tích máu thu được có thể từ 40-150 ml
- Thu nhận máu trong tử cung:
• Đứa bé được sinh ra ngoài nhưng nhau thai chưa đưa ra ngoài
• Thể tích tối thiểu thu nhận được là 75 ml
Sau khi thu nhận, máu cuống rốn được chuyển đến các phòng thí nghiệm để xử lý và đông lạnh
Trước khi máu được bảo quản phải xét nghiệm để kiểm tra virus như HIV, virus gây viêm gan siêu vi B và C, và kiểu mô để xác định kiểu HLA
Máu được ly tâm lạnh chậm đến (900C) và cuối cùng cho vào ni tơ lỏng (-1960C)
Câu 4: Khái niệm về ngân hàng mô và các nguyên tắc cơ bản của việc lập ngân hàng mô?
Ngân hàng mô
Mô động vật bao gồm tất cả các thành phần cấu thành của một cơ thể người và động vật, kể cả các phần bỏ trong phẫu thuật, nhưng loại trừ các cơ quan sừng hóa, các sản phẩm bỏ
Lập ngân hàng mô là những hoạt động sàng lọc các mẫu cho, thu nhận, xử lý tiệt trùng và xử lý bảo quản, lưu trữ và phân phát để phục vụ cấy ghép cho người, hoặc phục vụ các hoạt động nghiên cứu khoa học khác.
Mô của người có thể sử dụng cho các mục đích :
• Phục vụ chẩn đoán: xác định khối mô ung thư
• Ứng dụng liệu pháp: sử dụng cho cấy chuyển, phẫu thuật chỉnh hình…
• Cung cấp mẫu nghiên cứu lâm sàng và sinh học mô
Nguyên tắc cơ bản của việc lập ngân hàng mô
Sàng lọc người cho mô và xét nghiệm người cho mô
• Kiểm tra tình trạng cơ thể, sinh lý và bệnh lý của người cho mô
• Kiểm tra lịch sử bệnh có kết hợp với lâm sàng
• Các mô sẽ được loại bỏ nếu lịch sử nhân thân đã mắc một trong các bệnh sau: Các bênh có liên quan tới u ác tính, khối u não và bất kì ung thư nào, virus viêm gan, nhiễm HIV, bệnh lao, giang mai, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh virus toàn thân, hay bệnh nấm toàn thân, các trường hợp rủi ro truyền bệnh Crelz feldt- Jakob…
• Một số xét nghiệm tối thiểu cần tiến hành: Kháng thể virus HIV, kháng nguyên bề mặt virus gây viêm gan siêu vi B, kháng thể virus gây viêm gan C, bệnh giang mai
Quy trình chung cho ngân hàng mô
• Thu nhận mô: các mẫu mô từ người cho phải được thu nhận và bảo quản trong thời gian thích hợp để đảm bảo các chức năng sinh bảo quản trong thời gian thích hợp để đảm bảo các chức năng sinh học, cũng như yêu cầu sử dụng
• Quá trình xử lý mô: mô phải được xử lý theo các quy trình chuyên biệt đã được thiết lập cho mỗi loại
Đánh dấu: Tất cả các vật chứa mẫu phải được dán nhãn rõ ràng. Trên nhãn phải bao gồm: số xác định mô và mẻ mô, tên thích hợp cho sản phẩm mô, ngày hết hạn sử dụng, nhiệt độ bảo quản tốt nhất, tên ngân hàng mô
Lưu trữ: các yêu cầu cho việc lưu trữ bao gồm vật chứa lưu trữ thích hợp, kiểu đóng gói, nhiệt độ lưu trữ, cách thức lưu trữ và ngày hết sử dụng cho từng mô
Kiểm định: các mô phải được kiểm định tại bất kỳ giai đoạn nào của quá trình thao tác. Khi mô đưa ra ngoài cần đảm bảo tính an toàn, ổn định chất lượng của những mô đó
Câu 5: Nêu các chiến lược bảo quản cơ quan?
Có 3 chiến lược cho bảo quản cơ quan:
Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ cơ thể trên điểm dông lạnh và thấp hơn 370C
• Được sử dụng cho cấy ghép cơ quan khi người cho cơ quan và người nhận cơ quan ở 2 nơi xa nhau
• Cơ quan được ngâm chìm trong dung dịch bảo quản bằng cách bơm dung dịch thông qua các mạch
• Thường thì sự làm tràn ngập được tiến hành để giảm sự hư hại mạch. Dung dịch bảo quản được đưa vào ngay lập tức và cũng có hiệu quả làm lạnh cơ quan từ 370 C xuống 40 C
• Sau khoảng 1 giờ thiếu máu, có thể tạo môi trường ấm cho mô hay sau chừng 4 giờ thiếu máu, điều kiện nhiệt độ phải thấp hơn
• Các cơ chất bên ngoài như glucose sẽ được thay thế bằng các tác nhân không chuyển hóa như mannitol hay sucrose
• Sự cân bằng áp suất thẩm thấu và pH được kiểm soát tối ưu với các ion sẽ hơn là sử dụng dung dịch muối bình thường
• Citrate được thêm vào như là chất bắt giữ ion và làm giảm các phẩn ứng oxide hóa trong ty thể và làm tăng cường sự luân chuyển cơ chất trong các con đường chuyển hóa năng lượng
Đông lạnh và giải đông
• Có nhiều vấn đề khó khăn, đặc biệt là việc truyền nhiệt đều đặn trong một khối mô quá lớn, sự hiện diện của nhiều kiểu tế bào khác nhau trong một cơ quan, mỗi tế bào lại có nhiệt độ tối ưu cho sự đông lạnh khác nhau
• Các tinh thể đá ngoại bào có thể gây hư hại cấu trúc cơ quan nhất là thành phần mạch
• Có nhiều cách để tinh thể đá phá vỡ cơ chế bám hình thành giữa các tế bào, giữa tế bào với màng đáy
• Có nhiều stress cơ học tạo ra cho tế bào bởi sự biến đổi áp suất thẩm thấu của nước khe
Thủy tinh hóa
• Là chiến lược có hứa hẹn nhất cho việc bảo quản cả cơ thể sống
• Cách đây 20 năm, Greg Fahy quyết định mở rộng chương trình Luyet của các tế bào được bảo quản đông lạnh thông qua cơ chế thủy tinh hóa
• Những khó khăn phải đương đầu khi áp dụng chương trình này có thể gồm:
+ Làm thế nào để đạt được nồng độ cao của các dịch thủy tinh hóa vào cơ quan và tách bỏ chúng khi giải đông
+ Làm thế nào để ngăn chặn sự phân hủy của mô và của cả cơ quan
+ Làm thế nào làm lạnh các cơ quan thật nhanh đủ để ngăn chặn tối đa sự hình thành các tinh thể đá
+ Làm thế nào để làm ấm cơ quan nhanh đủ để ngăn chặn sự thủy tinh hóa + Làm thế nào ngăn chặn sự tốn thương lạnh gây ra trong suốt quá trình làm lạnh