Giải đông càng nhanh càng tốt. Đông lạnh chậm và giải đông nhằm làm giảm tối thiểu sự hình thành các tinh thể gây hư hại tế bào.
(1) Các ống đông lạnh tế bào được lấy ra khỏi bình nitơ lỏng (dùng găng tay, kẹp).
(2) Kiểm tra cẩn thận các nhãn và mũ ống để chắc chắn rằng nắp vẫn còn chặt. (3) Đặt toàn bộ ống đông lạnh vào bình ổn nhiệt 370C, lắc nhẹ đến khi tan nhiệt.
Chú ý rằng các ống đông lạnh có thể nổ khi giải đông. Điều này giải thích tại sao nhiều người sử dụng ống đông lạnh nhựa hơn là các ống bằng thủy tinh.
(4) Nội dung bên trong của các ống đông lạnh được chuyển sang ống nghiệm vô trùng 15 ml có chứa sẵn môi trường đã làm ấm.
(5) Rửa tế bào bằng cách li tâm nhẹ ở 800 vòng/ phút trong 3 – 5 phút. (6) Tái huyền phù tế bào trong môi trường tươi.
(7) Trải các tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường bình thường. Nồng độ tế bào ban đầu phải cao từ 2 – 3x104 tế bào/cm2. Đặt vào tủ ấm.
(8) Sau 1 – 3 ngày, các tế bào được pha loãng ở tỉ lệ cao (1/2 – 1/10) để cấy chuyển.
KỸ THUẬT VÔ TRÙNG VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO
Câu 1: trình bày các kỹ thuật vô trùng.phân tích phương pháp sử dụng nhiệt ấm trên 1000C
Câu 2: trình bày các kỹ thuật vô trùng.phân tích phương pháp chiếu xạ
Câu 3: trình bày các kỹ thuật vô trùng.phân tích phương pháp vô trùng bằng hóa chất Câu 4: trình bày các kỹ thuật vô trùng.phân tích phương pháp vô trùng bằng lọc Câu 5: trình bày phương pháp quan sát tế bào
Trả lời
I. Kỹ thuật vô trùng
1. Nhiệt ấm trên 1000 C
• Nước sôi, được dùng phổ biến trong phòng thí nghiệm, khử trùng hữu hiệu làm bất hoạt bào tử vi khuẩn, mầm nhiễm, kết hợp thêm với điều kiện khắc nghiệt hơn.
• Sử dụng nước ở nhiệt độ 1210C ( nồi hấp khử trùng). Mức độ sống sót của nội bào tử vi khuẩn được so sánh với chuẩn dùng phổ biến là 1210C trong 15 phút; có một vài chu trình đề nghị dùng nhiệt độ thấp hơn (1150C) hay cao hơn (1260C, 1340C). để bất hoạt prion đặc biệt, cần điều kiện khắc nghiệt đặc biệt hơn.
• Để sử dụng đạt hiệu quả cao thì thiết bị phải có đủ dung tích nước cần thiết. kiểm tra Chất lượng hơi nước. Lượng hơi nước trong nồi phải được cung cấp đầy đủ để áp suất không bị suy giảm, khi nồi hoạt động.
2. Chiếu xạ
a) Tia UV
• Bước sóng khoảng 260 nm,có khả năng làm bất hoạt vi sinh vật và cả virus. khử trùng không khí trong tủ nuôi hay phòng thao tác, khử trùng bề mặt.
Hạn chế :
• Tác động lên cấu trúc DNA, phá vỡ mạch kép làm tách mạch, tạo cấu trúc dimer và một số các sản phẩm đột biến. một số nội bào tử vi khuẩn và prion vẫn có khả năng kháng lại, hay tạo ra một dạng đột biến khác hoạt tính cao hơn.
• Không thể điều chỉnh được nhiều hoạt tính, cách sử dụng vẫn còn khá hạn chế.
b) Tia gamma
• Hoạt động chính trên nucleic acid, nhưng hiệu quả gián tiếp tạo nên những gốc tự do và hydrogen peroxide từ nước.
• Dùng để khử trùng những vật không chịu nhiệt (bình Roux, phin lọc, pipette, syringe, đầu tip, một số hóa chất như kháng sinh)
3. Vô trùng bằn hóa chất
a) Alcohol (loại 70%)
• Sử dụng phổ biến để sát trùng
• Cơ chế: vi khuẩn bị mất nước và chết (hiệu quả diệt khuẩn cao hơn cồn 90%.)
• có hiệu quả với những dụng cụ dễ bị nhiễm khuẩn: găng tay, bề mặt và nhiều ứng dụng khác.
b) Khí formaldehyde
- Dùng khử trùng ở lò thông khí, phòng thao tác và một số dụng cụ nhỏ. - Formaldehyde cũng là một loại khí độc, phải đề phòng tác hại.
- Một số loại tủ cấy vi sinh vật (loại tủ đóng kín và thông khí ra bên ngoài phòng) sử dụng khí formaldehyde để khử trùng một lần trong tuần, một lần trong tháng hay khi phát hiện có dấu hiệu nhiễm trong tủ.
4. Vô trùng bằng lọc
a) Bộ lọc vi khuẩn và nấm
• Đối với bộ lọc chất lỏng, chất liệu cấu tạo bộ lọc thường là cellulose acetate,
cellulose nitrate (hoặc cả hai chất đó), nylon hay polysulfone.
• Trên màng lọc có nhiều lỗ xếp riêng rẽ với cùng kích thước khoảng 0,2 µm. Ứng dụng: giữ lại vi khuẩn trên bề mặt lọc, loại bỏ một số lượng lớn các virus trong các sản phẩm của huyết thanh
• Lọc không khí như CO2 và O2 cung cấp cho sự phát triển của tế bào đang nuôi cấy.
• Một đơn vị lọc bao gồm phần bao lọc và bộ phận lọc, bộ phận lọc có thể được thay đổi, còn phần bao lọc được sử dụng lại khi có một bộ phận lọc khác thích hợp với nó. phần bao lọc cần được hấp khử trùng trước khi tái sử dụng.
b) Bộ lọc virus
• kích thước lỗ lọc cỡ 0,1 µm có thể lọc bỏ hầu hết những virus có kích thước lớn. Một số dạng màng lọc có kích thước cực nhỏ như 15 nm hay 35 nm cho phép
loại bỏ tối đa virus mà vẫn đảm bảo thành phần chất tan trong môi trường,nhưng cần thử nghiệm kiểm tra để chắc chắn rằng các protein không bị loại cùng với virus. Vd : loại trừ được virus tiêu chảy ở bò (Bovine viral diarrhea – BVDV) và một số virus khác tồn tại trong huyết thanh bê.
c) Máy lọc HEPA
• dùng để lọc một lượng lớn không khí dùng khử trùng phòng hay trong các tủ cấy.
• có khả năng lọc trên 99,97% các vật thể cỡ 0,3 µm hay lớn hơn. Vì thế, có thể chống lại không những vi khuẩn mà cả virus trong không khí, hay trong các giọt chất lỏng.
• Khi thao tác mẫu và hóa chất, bắt buộc phải thực hiện trong các buồn cấy vô trùng Class II.