Phôi sau khi đã hoạt hoá, được nuôi cấy in vitro với môi trường thích hợp . sau thời gian này, phôi sẽ phát triển tới blastocyst ( khoảng 200 tế bào), đây là giai đoạn thích hợp cho cấy truyền.
Câu 12, Nêu đặc điểm của các kĩ thuật tạo dòng vô tính Roslin , Honolulu, Handmade?
Kĩ thuật tạo dòng vô tính Roslin
- Dolly ra đời tại viện Roslin ( Scotland) – nơi mà Wilmut làm việc, nên cách thức tạo ra cừu Dolly được gọi là kĩ thuật tạo dòng Roslin.
- Trong thí nghiệm, Wilmut đã làm đòng bộ chu kì của tế bào cho nhân và trứng. Tế bào phải đưa về trạng thái Go hoặc trạng thái nghỉ, tương ứng với trứng.
- Các bước tiến hành:
• Bước 1: Nhân của trứng chưa được thụ tinh được tách ra
• Bước 2: Tế bào cho nhân bị bỏ đói để tế bào đi vào trạng thái lơ lửng, giống trạng thái trứng loại bỏ nhân
• Bước 3: Đặt hai tế bào lại gần nhau, dùng xung điện để dung nạp hai tế bào và kích thích phát triển
Trong nuôi cấy, thêm vào hoá chất Cytochalasin B có chức năng làm ngưng sự hình thành thể cực thứ hai
Trứng không chia đôi bộ nhân mới 2n vừa được chuyển vào.
Trứng chấp nhận bộ nhân mới 2n như là hợp tử và xúc tiến quá trình phát triển thành phôi sau khi được kích thích hoạt hoá.
• Bước 4: Phôi được nuôi đến giai đoạn trưởng thành và cấy truyền cho mẹ mang
Kĩ thuật tạo dòng vô tính Honolulu
- Kỹ thuật này được đưa ra bởi Wakayama là người đứng đầu nhóm nghiên cứu Honolulu , do vậy tên gọi kĩ thuật tạo dòng Honolulu ra đời với sự thành công rực rỡ: hơn 50 con chuột giống nhau về di truyền được tạo dòng hoàn hảo.
- Có ba khác biệt trong kĩ thuật Honolulu so với Roslin:
• Thứ nhất: Sử dụng cumulus( các tế bào xung quanh trứng) làm tế bào cho nhân. Các tế bào hạt này đang ở trạng thái nghỉ, không phát triển do đó dễ dàng tái thiết lập chương trình trong trứng( đã loại bỏ nhân) mà không cần bỏ đói trong dung dịch đặc biệt.
• Thứ hai: Thay vì dùng điện để dung nạp, ở đây nhân đã được vi tiêm vào trong vỏ trứng . Kĩ thuật này ít làm hư hại trứng hơn do vậy tạo nhiều thuận lợi để phôi phát triển khoẻ mạnh.
• Thứ ba: Đòi hỏi việc nuôi cấy trung gian được tiến hành tối thiểu một giờ sau khi tiêm nhân. Việc này giúp cho các tế bào trứng tự lựa chọn nhân phù hợp và chấp nhận nhân mới. Sau năm giờ tiếp theo , trứng mới được chuyển vào trong môi trường nuôi có chất kích hoạt sự phát triển giống như trong thụ tinh tự nhiên.
- Wakayama đã sử dụng các loại tế bào Sertoli , não và cumulus... . Tế bào Sertoli và tế bào não luôn ở giai đoạn Go, tế bào cumulus hầu như ở giai đoạn Go và G1( tế bào cumulus cho nhân hiệu quả cao hơn các tế bào còn lại)
- Các bước tiến hành:
• Bước 1: Nhân của trứng được tách ra.
• Bước 2:Tế bào cumulus được sử dụng như là tế bào cho, nhân của nó được chèn vào trong trứng đã loại nhân.
• Bước 3: Sau khoảng một giờ để trứng chấp nhận nhân mới, để trứng thêm 5-6 giờ nữa. Trong thời gian này trứng không phát triển.
• Bước 4: Các tế bào được đặt vào môi trường nuôi cấy khởi động cho việc phát triển , chức năng của môi trường này giống như là một shock nhiệt.
Trong nuôi cấy, thêm vào hoá chất Cytochalasin B có chức năng làm ngưng sự hình thành thể cực thứ hai
Trứng không chia đôi bộ nhân mới 2n vừa được chuyển vào
Trứng chấp nhận bộ nhân mới 2n như là hợp tử và xúc tiến quá trình phát triển thành phôi sau khi được kích thích hoạt hoá.
• Bước 5: Cấy phôi vào mẹ mang
Kĩ thuật tạo dòng vô tính Handmade( Handmade cloning – HMC)
- Gần đây các nhà nghiên cứu Đan Mạch và Oxtraylia phát triển một phương pháp tạo dòng mới, kinh tế và dễ thực hiện hơn so với các phương pháp truyền thống.
- Đây là một biến đổi của cả hai kĩ thuật chuyển nhân tế bào phôi và chuyển nhân tế bào sinh dưỡng. Điểm mới ở đây là màng ZP được tách ra sau khi tế bào trưởng thành và trước khi loại nhân.
- Các bước tiến hành:
• Sử dụng dao cắt trứng làm đôi, loại bỏ nửa có nhân.
• Sử dụng hai nửa trứng không có nhân, vỏ trứng tự bao tròn trở lại.
• Tế bào cho nhân được đưa vào dung hợp với vỏ.Tế bào được tạo thành với một nửa khối lượng tế bào chất của trứng
• Tương tự lần đầu, tiến hành cắt một trứng khác để có vỏ thứ hai .
• Đưa vào dung hợp với một tế bào mới, tế bào dung hợp khác hình thành.
• Tế bào dung hợp phát triển thành phôi.
• Đem phôi cấy truyền.
- Thuận lợi: không cần sử dụng hệ thống vi thao tác để loại bỏ nhân và dung hợp tế bào => chi phí giảm, không đòi hỏi kĩ năng cao để sử dụng hệ htống vi thao tác.
- Bất lợi: loại bỏ màng ZP có thể sẽ nguy hiểm cho phôi, nhưng cải tiến trong hệ thống nuôi thì phôi phát triển sẽ được cải thiện.
Câu 13, Quá trình phát triển của phôi sau khi đã được chuyển nhân diễn ra như thế nào?
Có năm sự kiện trong quá trình phát triển và biệt hoá , tương ứng với các bước tái thiết lập chương trình và phát triển của phôi sau khi đã được chuyển nhân.
1.Sự hoạt hoá phôi và phân cắt đầu tiên:
- Sự phát triển đầu tiên của phôi là hình thành bộ gen chức năng duy nhất của chính nó.
- Các cấu trúc chromatin đơn mới được hình thành và ổn định nhanh chóng để có thể điều hoà sự sao chép, do đó gen sẽ được thể hiện đúng các thời điểm cần thiết và đúng với các tiến trình khác của tế bào.
- Những biến đổi epigenetic , giống như sự khử methyl hóa của các gen không được in dấu, xảy ra trong suốt thời kì này.
- Do đó một trong những thử thách trong ở phôi chuyển nhân là phải ức chế sự biểu hiện các gen sinh dưỡng và hoạt hoá các gen cần thiết cho sự phát triển thành phôi.