(1) Hình thức batch ( theo mẻ) và fed batch( theo mẻ có cung cấp thêm tế bào):
Tế bào được nuôi cấy, phat triển đến mật độ hay sản phẩm cần thiết thì thu hoạch.
Thời gian nuôi cấy mẻ tùy thuộc vào mật độ tế bào cấy ban đầu, dòng tế bào và các đặc tính như tốc độ phát triển, động học sản xuất kháng thể của dòng tế bào.
Bioreactor phải được làm sạch, hấp khử trùng cho lần sản xuất tiếp theo.
(2) Hình thức chemostat ( nuôi cấy liên tục):
Tế bào được cấy và phat triển đến một mật độ nào đó, như kiểu batch. Sau đó, môi trường được bơm liên tục vào bioreactor với tốc độ không đổi và huyền phù tế bào chứa kháng thể được rút ra với tốc đọ tương đương.
(3) Hình thức perfusion (chảy tràn):
Bắt đầu giống như nuôi cấy lien tục, nhưng thay dịch huyền phù tế bào được rút ra thì tế bào được tách ra liên tục bằng cahs lọc hay lắng và được đưa trở lại bồn nuôi.
Sự gia tăng số lượng tế bào được bổ sung bằng sự gia tăng tốc độ bơm môi trường vào bioreactor. Tiếp tục thu nhận kháng thể chứa trong dich nổi thông qua một thiết bị lọc.
Batch và fedbatch được dung phổ biến nhất; chemostat và perfusion thì đòi hỏi thao tác, hóa chất nhiều hơn vì nó cho phép tạo MAbs lien tục.
Tất cả các phương pháp đều áp dụng được với hệ thống nuôi cấy đồng nhất và không đồng nhất, trừ chemostat.
Câu 1, Trình bày các khái niệm về dòng – tạo dòng và phân loại việc tạo dòng thành các phương thức khác nhau?
Trong sinh học , dòng dùng để chỉ những phân tử DNA, những tế bào hay những cơ thể hoàn chỉnh có cùng một cấu trúc di truyền.
Tạo dòng ( cloning) là khái niệm diễn tả những thao tác kĩ thuật nhằm tạo ra dòng, thường được dùng trong trồng trọt, chăn nuôi. Ở người , tạo dòng chỉ nên áp dụng cho cấp độ tế bào và gen nhằm mục đích trị liệu.
Phân loại:
Tuỳ vào đối tượng, mục đích và cách thức tiến hành có thể phân định việc tạo dòng thành các phương thức khác nhau:
-Tạo dòng phân tử( molecullar cloning): tạo dòng DNA.
+ Trong các nghiên cứu về gen( như giải trình tự...), thường phải cần số lượng bản sao DNA rất lớn từ một đoạn gen được xác định ban đầu. Các kĩ thuật tạo dòng phân tử nhằm cho ra một lượng lớn các bản sao DNA nói trên.
+ Có thể tạo dòng phân tử bằng một trong hai cách:
• Tạo dòng in vivo: các phân tử DNA mục tiêu được dòng hoá vào vector => biến nạp vào các tế bào như E.coli => tế bào E.coli nhân lên nhanh => các vector cũng được tăng số lượng bản sao.
• Tạo dòng in vitro: các đoạn DNA mục tiêu được nhân lên trong ống nghiệm thông qua phương pháp PCR( polymer chain reaction - PCR).
-Tạo dòng tế bào:
+ Có nhiều phương pháp để có thể cô lập một tế bào được quan tâm( thường là các tế bào sinh dưỡng hay tế bào ung thư).
+ Thông qua các kĩ thuật hoạt hoá và cấy chuyển liên tục, một dòng tế bào chuyên biệt ra đời từ một tế bào ban đầu.
+ Mỗi dòng tế bào có các tính chất riêng của mình nhằm phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau: nghiên cứu khoa học, sản xuất protein, kiển định sược phẩm, thực phẩm, kiểm tra độc tố.... + Hiện nay trên thị trường đã có hàng trăm dòng tế bào khác nhau được thương mại hoá.
+ Được định nghĩa như là một phương pháp sản xuất phôi, cho ra những cá thể giống nhau hoàn toàn, chúng là một dòng cá thể ban đầu, có cùng bộ gen, kể cả DNA của “ nhà máy năng lượng”- ti thể.
+ Mặc dù ti thể chứa DNA riêng và chúng có khả năng nhân lên độc lập với nhân, nhưng những dòng chuẩn thực sự sẽ có cùng DNA trong cả nhân và ti thể.
+ Thuật ngữ “ dòng” đôi khi được dùng với những cá thể có cùng DNA nhân , nhưng khác DNA ti thể.
-Tạo dòng liệu pháp( therapeutic cloning): còn gọi là tạo dòng trị liệu
+ Kĩ thuật này được sử dụng để sản xuất phôi nhằm mục đích thu nhận tế bào gốc, phục vụ cho việc sửa chữa mô bị hư hỏng hay khiếm khuyết.
+ Các tế bào gốc phôi có thể được biệt hoá in vitro thành các tế bào chức năng, mô hay cơ quan( chẳng hạn tạo mô gan, mô tim...) để cấy ghép.
+ Các tế bào thần kinh( chữa bệnh Alzheimer , Parkinson) hay tế bào da( thay thế mô da bị tổn thương, bỏng) đã được thu nhận thành công từ các tế bào gốc phôi nói trên.
Câu 2, Trình bày một vài đặc điểm về sự tạo dòng vô tính trong tự nhiên ?
- Bản chất của sinh sản vô tính là quá trình nguyên phân: sự phát triển của cá thể mẹ qua nhiều lần phân bào nguyên nhiễm => sự tách rời một phần cá thể ấy để hình thành một cơ thể con => các cá thể con này lại cho ra các thế hệ con cái tiếp theo.
Sự sinh sản vô tính tự nhiên ở động vật không xương sống:
- Nảy chồi( budding): Thuỷ tức sinh sản bằng cách nảy chồi
• Các chồi phát triển đủ lớn sẽ tách rời khỏi cơ thể mẹ.
• Một vài trường hợp cá thể con không rời khỏi cơ thể mẹ, chúng hợp thành một tập đoàn ngày một lớn( ví dụ như quần thể san hô)
- Phân mảnh( Fragmentation): cá thể mẹ tự phân ra hai hay nhiều phần bằng nhau, mỗi phần phát triển thành cá thể mới.
• Hải quỳ sinh sản bằng hình thức này.
• Ở giun đốt, nơi đầu mút thân sẽ tạo thành cá thể mới, đầu và các cơ quan thụ cảm sẽ hình thành trước khi cá thể bố mẹ phân mảnh.
• Ở bọt biển thấy được dạng biến đổi khác: một số tế bào chuyên biệt trở thành chồi mầm, chồi mầm được giải phóng, phát triển thành cá thể mới.
- Tái sinh( regeneration): là hiện tượng tái tạo một phần cơ thể khi bị huỷ hoại
• Ở sao biển: khi bị đứt mất một cánh, cánh này sẽ được mọc lại=> sự tái sinh này không được xem là sinh sản vì không tạo nên cá thể mới.
• Tuy nhiên trong một số trường hợp, con sao biển khi bị cắt thành nhiều phần thì những mảnh nhỏ có dính một phần trung tâm sẽ tái sinh thành những con sao biển mới => kiểu sinh sản vô tính
- Sinh sản vô tính là hình thức tương đối hiếm gặp ở các động vật có xương sống, một số sinh vật sị giao tử vừa có khả năng sinh sản vô tính, vừa có thể sinh sản hữu tính tuỳ thuộc điều kiện môi trường.
- Lợi ích:
• Sinh sản vô tính giúp quần thể phát triển nhanh trong điều kiện ổn định.
• Sinh sản hữu tính giúp cho sinh vật thích nghi nhanh hơn với sự thay đổi của môi trường.
- Một vài trường hợp sinh sản vô tính trong tự nhiên ở động vật có xương sống như:
• Sinh đôi cùng trứng ở người.
• Loài tatu( armadillo) chỉ rụng một trứng duy nhất trong chu kì một năm, sau khi được thụ tinh, phôi phân chia nguyên nhiễm tạo thành 4 tế bào phôi =>tạo ra 4 con tatu coa bộ máy di truyền giống nhau và cung giới tính.
- Trinh sản: là một hình thức sinh sản vô tính, trong đó con cái sản xuất trứng, trứng phát triển thành cá thể mới mà không cần được thụ tinh
• Cách sinh sản này xảy ra ở một số động vật bậc thấp như: cá , lưỡng thê
• Loài ong, kiến... sản sinh ra trứng( noãn), một số trứng không đựoc thụ tinh phát triển thành cá thể đơn bội, còn lại được thụ tinh và tạo thành cá thể lưỡng bội .
• Một số loài cá , thằn lằn...cá trứng sau khi giảm phân ở dạng đơn bội(n) lại được nhân đôi thành 2n.
- Mẫu sinh: là một hình thức sinh sản vô tính, trong đó xảy ra quá trình thụ tinh giữa trứng và tinh trùng nhưng tinh trùng chỉ đóng vai trò kích hoạt trứng mà không đóng góp bất kỳ nguyên liệu di truyền nào cho thế hệ con non.
• Ví dụ như loài cá vược đẻ con Mollienesia formosa, cá diếc bạc.
- Phụ sinh: quá trình tạo ra một cá thể lưỡng bội chỉ chứa thông tin di truyền của con đực, do vậy quần thể loài phụ sinh chỉ bao gồm những con đực. Tinh trùng sẽ được thụ tinh với trứng của loài có quan hệ gần gũi
• Ví dụ: loài cá A.nobilis sẽ thụ tinh với trứng của loài Cyprinus carpio để tạo hợp tử, hợp tử phát triển thành phôi, phôi chỉ chứa nguyên liệu di truyền của con đực
A.nobilis.
• Trinh sản giả( hibriogenesis): còn được gọi là trinh sản lai
o Con cái giao phối với con đực và cả hai đều đóng góp nguyên liệu di truyền cho con của chúng. Nhưng khi con cái trưởng thành, các trứng do chúng sản xuất không chứa nguyên liệu di truyền của cha, mà chứa một bản copy chính xác nguyên liệu di truyền của mẹ.
o Quá trình sinh sản tiếp tục thì cứ mỗi thế hệ sẽ mang một nửa vốn di truyền từ mẹ và một nửa vốn di truyền mới từ cha.
o Hình thức nói trên thường thấy ở các chủng cá Poeciliopsis.
Câu 3, Nêu cơ chế phát động giải phóng Ca2+ khởi động quá trình hoạt hoá trứng (oocyte activation) trong công nghệ tạo dòng vô tính động vật in vitro ?
- Với một số mục đích, tế bào trứng đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong kĩ thuật tạo dòng vô tính ở động vật có vú.
- Trứng động vật có vú sau khi chín rụng sẽ nghỉ ở kì metaphase giảm phân lần II(MII) ,nếu được thụ tinh trứng sẽ phát triển thành phôi. Hiện tượng trứng thoát ra khỏi kì nghỉ MII nhờ thụ tinh được gọi là sự hoạt hoá trứng.
- Sự hoạt hoá trứng bao gồm một chuỗi các thay đổi nội bào, được xếp thành các sự kiện sớm và muộn.
• Các sự kiện sớm bao gồm: sự thay đổi nồng độ ion calci nội bào, việc này sẽ khởi động tất cả các sự kiện khác của quá trình họat hóa, gồm phản ứng hạt vỏ ngăn cản hiện tượng đa tinh trùng xâm nhập trứng, bổ sung những mRNA của người mẹ và tiếp tục giảm phân tạo thể cực thứ hai.
• Các sự kiện muộn bao gồm hình thành tiền nhân đực và cái, tổng hợp DNA và bắt đầu chu kì nguyên phân đầu tiên.
a, Vai trò của Ca2+ trong hoạt hoá trứng:
- Ca2+ có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình hoạt hoá trứng.
- Có thể tăng hàm lượng Ca2+ trong trứng bằng cách: làm bộc lộ thể mang Ca2+ , hoặc tiêm trực tiếp Ca2+ , hay tạo lỗ màng xung điện để Ca2+ có thể đi vào bên trong trứng => làm thay đổi hình dạng trứng , giống như được kích hoạt bằng tinh trùng.
- Làm giảm nồng độ Ca2+ bằng cách thêm BAPTA-AM ( 1 yếu tố bắt giữ Ca2+ ) => ức chế tinh trùng và kéo theo quá trình ức chế sự hoạt hoá trứng.
b, Cơ chế phát động sự giải phóng Ca2+
- Sự hoạt hoá trứng thông qua sự gắn kết các tín hiệu thông tin( tinh trùng) với các receptor đặc hiệu( có liên kết với protein G ) trên bề mặt màng ZP( phôi được bảo vệ bằng một màng bảo vệ bên ngoài gọi là màng trong suốt, tên khoa học là zona pellucida ZP).
- Cơ chế tinh trùng phát động giải phóng ion Ca2+ chưa hoàn toàn sáng tỏ, một số giả thuyết về vai trò phát động giải phóng Ca2+ của tinh trùng:
Thuyết receptor: cho rằng trung tâm hoạt động như một ligand cho receptor trên màng plasma của trứng, tương tự như sự đáp ứng kích trên thích trên các tế bào sinh dưỡng.
- Khi một hormone( hay một ligand) gắn kết vào receptor, tế bào sẽ tạo ra sự dao động nồng độ Ca2+
-Sự hoạt hoá trứng được bắt đầu bằng việc giải phóng Ca2+ , trong đó nhân tố inositol 1,4,5- triphosphate (IP3 ) giữ vai trò quan trọng.
- Hai dạng receptor bề mặt tế bào có vai trò quan trọng là protein G và protein tyrosine kinase ( PTK) .
• Khi tinh trùng gắn vào thụ thể protein G để xâm nhập trứng:
o Trước hết, các tiểu phần α- protein G được hoạt hoá.
o Protein Gα sẽ kích thích PLCβ tạo ra các IP3
o Các IP3 lại gắn với một receptor IP3R nằm trên màng của mạng lưới nội chất( ER- nơi chứa Ca2+)kích thích giải phóng Ca2+=> trứng được hoạt hoá
• Đối với protein thyrosine kinase, quá trình diễn ra hoàn toàn tương tự, sự gắn kết của tinh trùng vào receptor này diễn ra làm cho:
o Protein thyrosine kinase sẽ kích thích enzyme PLCY tạo ra các IP3
o Từ đó dẫn đến giải phóng các ion Ca2+
Thuyết dung hợp: cho rằng những sản phẩm của tinh trùng đi vào cytoplasm trứng sẽ kích hoạt thay đổi nồng độ Ca2+
• Thứ nhất: có xảy ra sự vận chuyển của những thuốc nhuộm phát huỳnh quang từ tinh trùng sang trứng, khởi động sự dao động nồng độ Ca2+ khi các giao tử dung hợp.
• Thứ hai:khi tiêm dịch chiết của tinh trùng vào trong trứng nhiều động vật , thì sự đáp ứng thay đổi nồng độ Ca2+ giống như trong trường hợp tinh trùng xâm nhập vào trứng. Khi đó có thể kích thích trinh sản xảy ra và ngay cả khi tiêm tinh trùng đã bất hoạt khả năng hoạt hoá Ca2+ thì vẫn có khả năng thích trứng phát triển thành cá thể con.
• Cuối cùng sự thành công của kĩ thuật ICSI (intra- cytoplasmic sperm infection – kĩ thuật tiêm tinh trùng trực tiếp vào trứng) cho thấy tinh trùng không cần tiếp xúc, chúng vẫn có khả năng kích hoạt trứng => chứng tỏ dịch chất chứa trong tinh trùng sẽ kích hoạt sự dao động nồng độ Ca2+ để hoạt hoá trứng thông qua con đường kích thích phosphoinositide.
- Những phân tử có vai trò kích hoạt của tinh trùng chưa được biết rõ, có thể là những PLC isoform hay các chất hoạt hóa PLC.
- Hai protein được đề nghị có vai trò tham gia hoạt hoá là glucosamine 6- phosphate deaminase và tr- kit
- Khi vào trứng , tinh trùng sau khi gây cảm ứng màng noãn ,các chất trên sẽ hoạt hoá PLC, PLC sẽ biến đổi PIP2 thành IP3 và kích thích giải phóng Ca2+
- Thành phần hoạt hoá của tinh trùng/ nhân tố tinh trùng( sperm factor- SF) có thể có khả năng khởi sự và duy trì sự sản xuất IP3 trong suốt quá trình thụ tinh.
- PCL tinh trùng được cho là có hoạt tính ở nồng độ thấp Ca2+ .
- Khi tiêm PCL tái tổ hợp với nồng độ cao hơn nhiều so với nồng độ cần thiết thì sự hoạt hóa trứng không diễn ra.
Câu 4, Nêu các đặc điểm của sự in dấu di truyền( imprinting) trong công nghệ tạo dòng vô tính động vật in vitro?
Đây là hiện tượng mà một nhóm gen trong bộ gen động vật khi biểu hiện phải phụ thuộc vào gen của cha mẹ chúng. Ở thế hệ con, một số gen được in dấu thừa hưởng từ cha có thể biểu hiện và các gen in dấu thừa hưởng mẹ có thể im lặng hay ngược lại.
Do vậy , các dấu in ( imprint) có thể hoạt động như là một nhân tố gây im lặng ( silencer) hoặc là một nhân tố hoạt hóa( activator) đối với các gen được in dấu.
- Để một phôi phát triển bình thường cần cả hai nhóm NST in dấu từ mẹ và in dấu từ cha. Nếu phôi chỉ được tạo ra từ hai NST chỉ của cha hay mẹ thì có thể xuất hiện nhiều bất thường, khả năng gây chết ở phôi cao.
- Những gen được in dấu thường có những dấu in bên trên hay ở gần ngay gen đó. Sự in dấu này đặc trưng cho từng cá thể gọi là kiểu in dấu( imprinting pattern) => những bản sao của gen mà thế hệ con được thừa hưởng từ mẹ sẽ khác nhiều so với gen được thừa hưởng từ cha.
- Trong phôi và thế hệ con sau này, những dấu in đó sẽ kiểm soát sự biểu hiện của các gen. Một trong những dấu in đã được biết rõ nhất là nhóm hoá học methyl, chúng gắn vào những
mảnh DNA trong vùng gần với những gen được in dấu nên được gọi là vùng kiểm soát dấu