3 bước cơ bản:
CHƯƠNG 5: NHỮNG KỸ THUẬT LIÊN QUAN ĐẾN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
VẬT
PHÁT HIỆN NHIỄM & ĐÔNG LẠNH
Câu 1: Các tác nhân chính gây nhiễm và cách phát hiện? Câu 2: Nhiễm chéo là gì? Cách tránh nhiễm chéo như thế nào? Câu 3: Yêu cầu đối với phòng nuôi cấy trong việc ngăn ngừa nhiễm
Câu 4: Một số vấn đề quan trọng để giữ sạch phòng và giảm thiểu sự nhiễm mẫu? Câu 5: Cơ sở của việc loại bỏ nhiễm? các bước tiến hành?
Câu 6: Mục đích và hạn chế của kỹ thuật đông lạnh? Câu 7: Quy trình Bảo quản tế bào
Câu 8: Quy trình hoạt hóa tế bào Câu 9: Quy trình đông lạnh cơ bản Câu 10: Quy trình giải đông cơ bản
Câu 1: Các tác nhân chính gây nhiễm và cách phát hiện?
Nấm mốc có thể phát triển bên ngoài các đĩa nuôi cấy và trên các bề mặt nhựa, kim loại hay thủy tinh. Các loại vi nấm và bào tử vi khuẩn có mặt khắp nơi, chúng bám vào bất kỳ cái gì có trong phòng thí nghiệm và cơ thể người. chúng thường có dạng sợi, dễ dàng phát hiện bằng mắt thường.
Mycoplasma phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm men, không phá hủy trực tiếp hay tức thời các tế bào. Chúng làm thay đổi chức năng và chuyển hóa của tế bào, gây sai hỏng NST, ảnh hưởng đến tính kháng nguyên bề mặt, can thiệp vào trong sự tổng hợp nucleic acid, và nhìn chung, làm thay đổi tập tính của tế bào
Giống như vi khuẩn và nấm men, Mycoplasma có kích thước rất nhỏ, không thể quan sát trực tiếp , trừ khi đánh dấu huỳnh quang và sử dụng kính hiển vi điện tử. Phương pháp nhuộm huỳnh quang sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33258 để gắn chuyên biệt DNA. Mycoplasma chứa DNA nên có thể thấy các đốm nhỏ phát sáng trong cytoplasm.
Sử dụng những bộ kít thương mại để sàng lọc mycoplasma hoặc sử dụng các kháng thể chuyên biệt hay chạy PCR
Các virus nội sinh rất khó và tốn kém để xác định. Đó là các virus thường nhiễm như Sendai virus, virus khỉ, virus bệnh gan người hay chuột, virus Epstein Barr, cytomegalovirus người, HIV và những retrovirus nội sinh.
Các retrovirus ngoại sinh hầu như không được phát hiện trong nuôi cấy tế bào nếu như không sử dụng các phương pháp sinh hóa hoặc kiểu huyết thanh, hoặc kính hiển vi điện tử.
Các đối tượng gây nhiễm Khi triển nhiều trong môi trường sẽ làm môi trường đục và có mức acid cao. Do đó, cần kiểm tra thường xuyên và có biện pháp xử lý nhiễm. Chú ý không mở nắp đĩa nuôi tránh phát tán trong không khí, nhiễm cho các đĩa khác.
Nếu sau khi kiểm tra khẳng định mẫu bị nhiễm, hãy cách li các đĩa nuôi đó và khử trùng. Sát trùng kính hiển vi, vị trí đặt đĩa nuôi, tay, các dụng cụ khác bằng cồn 700.
Câu 2: Nhiễm chéo là gì? Cách tránh nhiễm chéo như thế nào?
Nhiễm chéo là kiểu nhiễm dòng tế bào này với một dòng tế bào bình thường khác. (Còn gọi là các dòng tế bào nhiễm chéo)
Sự nhiễm chéo có thể xảy ra khi nuôi cấy trộn lẫn trong một thời gian dài hay những tế bào nhiễm có thể trở thành ưu thế, làm mất đi dòng tế bào ban đầu. Nếu các dòng tế bào giống nhau về hình dạng và thu nhận ở cùng loài, khi đó sự nhiễm có thể kéo dài trong nhiều năm, nhưng không thể phát hiện được.
Cách tránh nhiễm chéo như thế nào?
- Không đặt hai dòng tế bào khác nhau trong cùng một ngăn (khi đông lạnh), hay trên cùng một vị trí bề mặt (khi nuôi trong tủ ấm).
- Không bao giờ sử dụng một pipette, đầu tip hay bất kỳ một dụng cụ chung cho hai dòng tế bào khác nhau, khi thao tác chúng.
- Lau sạch bề mặt nơi nuôi cấy, rửa sạch tay hay găng tay giữa các lần thao tác với các dòng tế bào khác nhau.
- Khi đông lạnh, các dòng tế bào phải được giữ riêng trong các lọ, chai thủy tinh khác nhau đã được kiểm tra kĩ sự rò rỉ.
- Nếu nghi ngờ một dòng tế bào đã nhiễm bởi tế bào khác, nhanh chóng hủy nó. Giải đông tế bào của dòng đó còn lưu giữ lạnh, nuôi và xác định chính xác sự nhiễm này.
Câu 3: Yêu cầu đối với phòng nuôi cấy trong việc ngăn ngừa nhiễm
Phòng nuôi cấy tế bào phải
- Giới hạn số người làm việc
- Thiết kế sao cho Áp suất được phân bố theo kiểu “khóa không khí” (airlock) (còn gọi là hàng rào sạch). Áp suất bên trong phòng cao hơn bên ngoài, nhưng thấp hơn áp suất trong phòng nuôi cấy tế bào.
- Lối vào phòng thí nghiệm nên đặt những tấm thảm dính để bắt giữ bụi, dơ của đế giày dép.
- Lọc Không khí phòng nuôi qua màng lọc HEPA
- Những người tiến hành thí nghiệm, trước khi vào phòng phải tắm rửa, sát trùng và mặc áo blouse, găng tay, vớ chân để hạn chế tối đa các bề mặt của cơ thể tiếp xúc với không khí. Phải rửa tay hay thay găng tay liên tục sau mỗi lần thao tác.
- Không được mang thức ăn, đồ uống vào phòng nuôi cấy.
- Bên trong vùng thao tác phải đặt đèn UV. Sự di chuyển người và thiết bị ra vào phòng phải giảm tối thiểu.
Câu 4: Một số vấn đề quan trọng để giữ sạch phòng và giảm thiểu sự nhiễm mẫu?
- Các bề mặt nuôi cấy, buồng thao tác, kính hiển vi, tủ nuôi và những bề mặt thao tác khác phải được lau chùi định kỳ bằng cồn hay các tác nhân diệt khuẩn khác.
- Bên trong tủ lạnh phải luôn sạch sẽ, gọn gàng. Không giữ, chứa các ống nghiệm, chai lọ trong 1 thời gian dài. Mở nắp chai lọ phải đúng cách, đúng chỗ.
- Các bồn nước là một nguồn chính của nhiễm. Nếu nước được sử dụng chứa các tác nhân nhiễm khuẩn nên thay đổi thường xuyên.
- Tủ ấm vừa cũng là nơi có điều kiện tối ưu cho các tác nhân gây nhiễm phát triển. Nước tạo ẩm cho tủ phải được vô trùng và nên chứa một số tác nhân khử trùng bền. - Các mâm hay khay trong tủ ấm được mang ra ngoài phải được khử trùng và giữ trong
không gian sạch cho đến khi sử dụng.
- Lau chùi sạch sẽ, hấp khử trùng ngay khi thấy các vật dụng nuôi cấy có chứa các dấu hiệu của nhiễm vi khuẩn hay nấm mốc…
Câu 5: Cơ sở của việc loại bỏ nhiễm? các bước tiến hành?
Nguyên tắc : Cách tốt nhất để loại bỏ sự nhiễm trong nuôi cấy là bỏ đi các đĩa, vật dụng đã nhiễm. Thậm chí, khi cần thiết sẵn sàng hủy bỏ cả các mẫu thí nghiệm. Khi đó, các nguồn tế bào đông lạnh hay các nơi cung cấp hoặc các dòng tế bào phân lập phải được xử lí lại trước khi quyết định tái sử dụng
Các bước tiến hành:
Bước 1: triệt tiêu (hay làm giảm) sự nhiễm đến mức thấp nhất. Có thể thao tác cơ học để tách các tiểu phần nấm mốc, rửa các tế bào nhiễm khi nhiễm với nấm men, vi khuẩn hay mycoplasma. Rửa xong dụng cụ, tiếp tục xử lý bằng các chất kháng khuẩn và kháng nấm.
Bước 2: Tái thiết lập dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Bước 3: nuôi và cấy chuyền trong môi trường không có kháng sinh. Bước 4: thu nhận lại và kiểm tra nhiễm một lần nữa.
Câu 6: Mục đích của kỹ thuật đông lạnh. Hạn chế của kỹ thuật này
Mục đích: Kỹ thuật đông lạnh nhằm giữ tế bào trong nitơ lỏng ở nhiều năm với khả năng sống sót cao
Với các tế bào người bình thường, thời gian sống in vitro có giới hạn. Đông lạnh là cách duy nhất để sử dụng một dòng tế bào trong nhiều thí nghiệm khác nhau.
Ngân hàng tế bào đông lạnh sẽ cung cấp thường kì các dòng tế bào chuẩn, chúng được giải đông , sau đó nuôi cấy thứ cấp.
Hạn chế:
- Có thể tạo ra dị hợp trong tế bào
- Cơ hội nhiễm, nhất là nhiễm chéo, hoặc lan rộng các tác nhân
- như mycoplasma
- Các tế bào giữ trữ tại (-1800C) thường giảm sức sống
Câu 7: Quy trình Bảo quản tế bào Câu 8: Quy trình hoạt hóa tế bào Câu 9: Quy trình đông lạnh cơ bản Câu 10: Quy trình giải đông cơ bản
7. Bảo quản tế bào
(1) Tách tế bào trong bình Roux bằng trypsin.
(2) Huyền phù tế bào bằng cách hút sục bằng pipette 1 ml với bóp cao su. (3) Hút dịch huyền phù tế bào vào 2 eppendorf, mỗi cái 1 ml.
(4) Li tâm 1000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C. Bỏ dịch nổi.
(5) Cho vào mỗi eppendorf 900 ml môi trường, vortex để huyền phù tế bào. (6) Hút dịch huyền phù ở 2 eppendorf cho vào tube bảo quản tế bào 2 ml, bổ sung thêm 200 ml DMSO, trộn đều bằng pipetman hay vortex.
(7) Để tube bảo quản vào hộp xốp bên trong có lót bông gòn, đặt vào tủ lạnh (- 700C) qua đêm (để nhiệt độ tube bảo quản tế bào hạ xuống từ từ khoảng 10C/ phút).
(8) Bảo quản tube tế bào trong nitơ lỏng (viết tên tế bào, ngày bảo quản lên tube).