Phản ứng khuếch đại được thực hiện với tổng
thể tớch 50 àl bao gồm: 25àl MyTaq™ Mix 2ì (Bioline), 2 àl mỗi loại mồi xi và mồi ngược (nồng độ mồi 10 àM), 2 àl ADN khn (~ 200 ng) và nước cất. Điều kiện phản ứng đối với chu kỳ nhiệt nhõn đoạn gen COI, Dloop là: giai đoạn khởi đầu ở 94º0ºC trong 2 phỳt; tiếp đú là 35 chu kỳ bao gồm (giai đoạn biến tớnh ở 940ººC trong 30 giõy; giai đoạn gắn mồi ở 580ººC trong 15 giõy; giai đoạn kộo dài ở 72º0ºC trong 30 giõy); giai đoạn kết thỳc kộo dài ở 720ºC trong 5 phỳt và giữ ở 40ºC. Sau khi phản ứng kết thỳc lấy 3àl sản phẩm điện di trờn gel agarose 1,5% để kiểm tra kết quả sản phẩm PCR.
Tinh sạch sản phẩm PCR1: Sử dụng kit tinh sạch sản phẩm PCR, QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen. Quy trỡnh tinh sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phản ứng PCR giải trỡnh tự (PCR2): Thành phần của phản ứng PCR giải trỡnh tự trong tổng thể tớch 20 àl bao gồm: 8 àl DTCS Quick Start Kit, 0,5-10 àl sản phẩm PCR1 đó tinh sạch đảm bảo nồng độ 50 ng/100 fmol, 2 àl Primer (1,6 pmol/àl hoặc 1,6 àM). Sau đú cho nước cất lờn tổng thể tớch 20 àl. Chu trỡnh nhiệt cho phản ứng PCR2 là 30 chu kỳ bao gồm: 960ºC trong 20 giõy, 500C trong 20 giõy và 600C trong 4 phỳt. Cuối cựng giữ ở 40C.
Tinh sạch sản phẩm PCR2: Tinh sạch bằng Ethanol (Merk) theo quy trỡnh sau: Chuyển tồn bộ sản phẩm PCR2 (20 àl) sang ống eppendorf đó chứa 5 àl dung dịch ngừng phản ứng bao gồm: 2 àl 3M Natri Acetat pH 5,2; 2 àl EDTA 100 mM; pH 8,0, 1 àl Glycogen 20 mg/ml. Thờm 75 àl Ethanol 95% lạnh bảo quản trong –200C, voltex, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 20 phỳt tại 4º0C. Bỏ dịch nổi phớa trờn, giữ lại ADN kết tủa ở đỏy ống. Rửa kết tủa bằng 200 àl Ethanol 70% lạnh bảo quản trong –200C, voltex, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 3,5 phỳt tại 4º0C. Bỏ dịch nổi phớa trờn, giữ lại ADN kết tủa ở đỏy ống. Bước này thực hiện 2 lần. Để khụ tự nhiờn ở nhiệt độ phũng. Hũa tan ADN kết tủa bằng 40 àl SLS.
Thực hiện giải trỡnh tự trờn mỏy GenomeLab GeXP: Chuyển toàn bộ dung dịch ADN hũa tan trong SLS từ bước tinh sạch vào giếng tương ứng trờn đĩa chạy mẫụ Nhỏ 1 giọt dầu (mineral oil – được cung cấp kốm theo DTCS Quick Start Kit) lờn trờn để
trỏnh bay hơi mẫụ Đặt đĩa mẫu và đĩa đệm vào mỏy giải trỡnh tự. Cài đặt và chạy chương trỡnh.
2.3. Xử lý số liệu
Cỏc trỡnh tự gen được kiểm tra chất lượng bằng phần mềm Finch TV 1.4.0 (http://www. geospizạcom). Tiếp theo, chương trỡnh ClustalW Multiple Alignment trong BioEdit 7.1.9 (Hall, 1999) được sử dụng nhằm so sỏnh, căn chỉnh trỡnh tự, sau đú được kiểm tra và xỏc định mức độ tương đồng. Cỏc chỉ số đa dạng di truyền kiểu đơn - Haplotype diversity (h) và đa dạng nucleotit - Nucleotide diversity (π) được tớnh tồn bằng cỏch sử dụng phần mềm DnaSP v6.10.01 (Rozas và ctv., 2017). Phần mềm Arlequin v.3.11 (Excoffier và ctv., 2005) được dựng để đỏnh giỏ sai khỏc di truyền, mức độ khỏc biệt bờn trong và giữa cỏc đàn qua phõn tớch FST (Population pairwise FST) và phương sai phõn tử AMOVẠ
Cõy phỏt sinh loài phõn tử thể hiện mối quan hệ di truyền giữa cỏc đàn cỏ nghiờn cứu được xõy dựng dựa trờn phương phỏp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) gồm 8 trỡnh tự, trong đú cú 7 trỡnh tự phổ biến (consensus sequence) được xõy dựng cho từng đàn và 1 trỡnh tự đó được cụng bố trờn NCBI (mó số NC001606; Chang và ctv., 1994). Cỏc đơn vị phõn loại liờn kết được nhúm lại với nhau trong thử nghiệm bootstrap (1000 lần lặp lại) được hiển thị bờn cạnh cỏc nhỏnh. Cõy được vẽ theo tỷ lệ, với độ dài cỏc nhỏnh bằng đơn vị của khoảng cỏch tiến húa được sử dụng để suy ra cõy phỏt sinh lồị Cỏc phõn tớch tiến húa được thực hiện trong MEGA X (Kumar và ctv., 2018).
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đa dạng haplotype và nucleotide
Tất cả cỏc trỡnh tự trước khi đưa vào phõn tớch bằng phần mềm đều được xỏc định mức độ tương đồng với trỡnh tự gen đó được cụng bố trờn ngõn hàng gen NCBI dựa trờn cụng cụ BLAST. Kết quả cho thấy, cỏc trỡnh tự gen nghiờn cứu cú độ bao phủ rất cao (100%) và độ tương đồng cao (97,7-100%) so với cỏc trỡnh tự đó được cơng bố. Sau khi loại bỏ cỏc vựng trỡnh tự nhiễu (đoạn đầu và đoạn cuối) cho kớch thước đoạn gen nghiờn cứu là 760 bp đối với gen COI và 695 bp đối với gen D-loop. Kết quả phõn tớch đa dạng di truyền của cỏc đàn cỏ chộp dựa trờn 2 gen này được thể hiện ở bảng 3.
Nông nghiƯp và phỏt triển nụng thụn - KỲ 2 - THáNG 5/2021
96
Bảng 3. Tổng hợp đa dạng haplotype và nucleotide của cỏc đàn cỏ chộp phõn tớch trờn đoạn gen COI và D-loop
COI D-loop STT Đàn cỏ N n p h π N n p h π 1 VN 17 6 4 0,772 0,00311 17 16 15 0,993 0,01355 2 V1 20 8 3 0,863 0,00534 20 15 11 0,958 0,01879 3 HV 20 1 0 0 0 20 4 1 0,5 0,00339 4 IN 20 3 0 0,484 0,00182 20 7 2 0,821 0,00722 5 TAT 20 2 1 0,189 0,00025 20 1 0 0 0 6 SZA 20 1 0 0 0 20 5 1 0,511 0,00120 7 SE 20 1 0 0 0 20 8 4 0,826 0,01188 Tổng số 137 13 8 0,732 0,00374 137 40 34 0,829 0,01234 Ghi chỳ: N: số trỡnh tự được phõn tớch; n: số lượng haplotype; p: số lượng haplotype đặc trưng; h: đa dạng haplotype; π: đa dạng nucleotidẹ
Đối với gen COI, kết quả nghiờn cứu đó chỉ ra cú 13 haplotype khỏc nhau cho 7 đàn cỏ chộp, trỡnh tự cỏc haplotype này đó được cụng bố trờn GenBank - NCBI số hiệu MW450991 - MW451003. Cụ thể, đàn cỏ chộp V1 cú nhiều haplotype nhất (8), trong khi đú 3 đàn HV, SZA, SE chỉ cú 1 haplotype duy nhất. Tuy V1 xuất hiện ở nhiều dạng haplotype nhất nhưng đàn VN mới là đàn cú nhiều haplotype đặc trưng nhất (4), tiếp đến là đàn V1 (3), cuối cựng là đàn TAT (1). Bốn đàn cỏ cũn lại (bao gồm IN, HV, SE và SZA) khụng cú haplotype đặc trưng. Giỏ trị đa dạng haplotype h (trung bỡnh là 0,732) và đa dạng nucleotide π (trung bỡnh là 0,00374) nhỡn chung là cao khi so sỏnh với một số loài cỏ nước ngọt khỏc đó được nghiờn cứụ Đàn V1 cú đa dạng haplotype và đa dạng nucleotide cao nhất (h = 0,863, π = 0,00534). Trong khi đú, 3/7 đàn được nghiờn cứu cú đa dạng haplotype và đa dạng nucleotide đều bằng 0 (đàn HV, SZA và SE). Điều đú phản ỏnh khơng cú sự biến đổi di truyền ở đoạn gen nghiờn cứu giữa cỏc cỏ thể được phõn tớch trong cỏc đàn nàỵ Theo nghiờn cứu của Zhao và ctv (2020) sử dụng chỉ thị khuếch đại đoạn gen COII (Cytochrome c oxidase submit 2) để nghiờn cứu biến dị di truyền trờn 196 mẫu cỏ chộp thuộc 5 quần thể tự nhiờn và 10 đàn nội địa (6 đàn Trung Quốc, 4 đàn chõu Âu) đó cho thấy đa dạng haplotype (h = 0,761) cao hơn nhưng đa dạng nucleotide (π = 0,0024) là thấp hơn nghiờn cứu của chỳng tụị
Đối với gen D-loop, kết quả phõn tớch 137 trỡnh tự thuộc 7 đàn cỏ nghiờn cứu đó chỉ ra cú 40 haplotype khỏc nhau, trỡnh tự cỏc haplotype này đó được cụng bố trờn GenBank với số hiệu là MW463062 - MW463101. Đàn VN là đàn cú số lượng haplotype nhiều nhất (16 haplotype/17 mẫu nghiờn
cứu) và cũng là đàn cú nhiều haplotype đặc trưng nhất (15). Tiếp đú là đàn V1 với nvà plần lượt là 15 và 11. Trong khi đú đàn TAT chỉ cú 1 dạng haplotype và khơng cú haplotype đặc trưng dẫn đến h và π đều bằng 0. Cỏc đàn cỏ cú nhiều haplotype dẫn đến đa dạng haplotype và đa dạng nucleotide cao và ngược lạị Trong đú đỏng chỳ ý là đàn VN cú h cao nhất (0,993), tiếp đú là V1 (0,958). Cỏc đàn cú nguồn gốc từ Hungary (HV, TAT và SZA) nhỡn chung cú cỏc giỏ trị n, p, h, π thấp, cỏc đàn cịn lại ở mức độ trung bỡnh. So sỏnh với nghiờn cứu của Thỏi Thanh Bỡnh và ctv (2006) sử dụng phương phỏp kết hợp giữa giải trỡnh tự ADN và phõn tớch đa hỡnh cấu trỳc sợi đơn (SSCP) tại gen D-loop trờn 968 mẫu cỏ chộp thu tại cỏc vựng khỏc nhau ở Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Đài Loan cho thấy đa dạng haplotype (trung bỡnh 0,4) thấp hơn nghiờn cứu của chỳng tụị
Trong nghiờn cứu này, cỏc đàn HV, TAT, SZA, SE và IN là kết quả của cỏc chương trỡnh chọn giống hoặc đó được nhập nội từ nhiều năm trước đõỵ Sau khi đạt được cỏc mục tiờu mà chương trỡnh chọn giống đó thiết kế (như sinh trưởng nhanh, tỷ lệ sống cao, hệ số chuyển đổi thức ăn thấp) thỡ cỏc đàn cỏ chọn giống hoặc đàn nhập nội chỉ được tỏi đàn để lưu giữ qua cỏc năm. Đõy cú thể là lý do chớnh dẫn đến việc làm giảm biến dị di truyền trong cỏc đàn cỏ này dựa trờn cỏc đoạn gen đó nghiờn cứụ Ngược lại, đàn VN và V1, xuất hiện ở nhiều dạng haplotype và cũng là những đàn cú nhiều haplotype đặc trưng nhất khi xột trờn cả 2 gen COI và D-loop. Điều này cú thể được giải thớch bởi nguồn gốc của hai đàn cỏ nàỵ Đối với đàn cỏ V1, đõy là cỏ chộp chọn giống thế hệ chọn lọc thứ 6 của những cỏ lai 3 mỏu (hay cũn gọi là con lai kộp) giữa cỏ chộp Việt Nam, Hungary và
Nụng nghiệp và phỏt triển nụng thôn - KỲ 2 - THáNG 5/2021 97 Indonesia (tiến hành từ 1984 - 1995), trong khi đú