Ưu điểm: Nhanh, độ chọn lọc cao, đo đồng thời nhiều thành phần trong cùng một mẫu, độ bền cột tách cao.
Nhược điểm: Do là hệ ghép nối giữa hai hãng khác nhau nên kỹ thuật vận hành phức tạp hơn.
Hệ thống cảm ứng cao tần ghép nối khối phổ (ICP-MS)
ICP là nguồn năng lượng kích thích phổ có nhiệt độ cao và ổn định hơn so với các loại nguồn kích thích khác, được phối hợp với các máy đo phổ nhằm nâng cao hiệu quả phân tích. Hai phương pháp phân tích ICP phổ biến hiện nay là ICP-AES và ICP-MS do có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp khác nhờ có nguồn plasma có thể tạo nhiệt độ từ 5000 - 10000oC, so với 3000oC ở phương pháp hấp thụ nguyên tử, ngọn lửa N2O + C2H2. Với nhiệt lượng lớn như vậy đảm bảo sự hóa hơi và phân li hồn tồn của mẫu phân tích. Đây cũng là nguồn năng lượng kích thích phổ phát
xạ đảm bảo cho q trình phân tích có độ nhạy rất cao, có thể đạt 0,1 đến 5 ng/mL đối với hầu hết các ngun tố[26,36]. Bên cạnh đó, tín hiệu phân tích của chất cần phân tích khơng phụ thuộc vào dạng tồn tại hóa học của chất, nó chỉ phụ thuộc vào tổng lượng chất đi vào plasma. Thêm nữa, ICP-MS có khả năng phân tích đồng thời đa nguyên tố, khoảng tuyến tính động học rộng và quan trọng nhất là có khẳ năng phân tích các đồng vị của nguyên tố. Do đó phương pháp ICP-MS có khả năng phân tích nồng độ tuyệt đối của chất phân tích thơng qua phương pháp pha tích pha lỗng đồng vị (ID-MS: isotope dilutiom mass spectrometry)[32,60].
Chính vì tính ưu việt của phương pháp, nên tôi quyết định chọn HPLC-ICP- MS là phương để phân tích 4 dạng Se: selenate(SeVI), Selenit(SeIV), seleno-DL- methionione(Se-DLMet) và seleno-methyl-selenocystine(SeMeCys) cho nghiên cứu này.
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu của selen trong phân tích dạng dạng
1.3.2.1. Ảnh hưởng cácbon tới cường độ tín hiệu của Se trong phân tích dạng
Cácbon được ứng dụng nhiều trong phổ khối plasma cảm ứng (ICP-MS). Nó có thể được tìm thấy ở trong các mẫu mơi trường, dinh dưỡng, lâm sàng và hóa dầu. Ngồi ra, trong q trình xử lý mẫu thường sử dụng dung mơi có chứa cácbon (ví dụ: chiết / lấy mẫu) hoặc làm dung môi rửa giải trong các kỹ thuật phân tích sắc ký. Sự có mặt của cácbon trong plasma là một nguồn gây nhiễu tín hiệu trong ICP-MS[51]. Trong một số nghiên cứu đã chứng minh rằng. Cường độ tín hiệu của các ngun tố khó ion hóa có chứa cácbon tăng so với dung dịch khơng chứa cácbon. Vấn đề này phụ thuộc vào: nguyên tố, các điều kiện thí nghiệm được sử dụng (cơng suất, tốc độ dịng khí phun, tỷ lệ hấp thu mẫu) và nồng độ cácbon[27,49].
Các nguyên tố bị ảnh hưởng
Nghiên cứu có tính hệ thống về ảnh hưởng của cácbon đến tín hiệu của một số ngun tố khó ion hóa ( B, Be, P, S, Zn, Se, Se, Pd, Cd, Sb, I, Te, Os, Ir, Pt, Co, Ag, Rb và Hg) trong quang phổ khối cảm ứng plasma đã được thực hiện[50]. Sự có mặt của cácbon làm tăng cường độ của các nguyên tố theo thứ tự giảm khối lượng. Điều
này là do sự thay đổi không gian của vùng mật độ ion tối đa. Do đó, ảnh hưởng đến việc tách ion từ plasma đến detector. Khi nồng độ methanol cao cũng gây ức chế cường độ của các nguyên tố do cản trở hiệu ứng làm mát plasma.
Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng tín hiệu của các nguyên tố như: P, Se, Se, Sb, Te, I, Au và Hg có sử dụng dung mơi hữu cơ ln cao hơn so với dung mơi khơng có cácbon. Bên cạnh đó cũng liên quan đến phản ứng chuyển tải tích điện trong các hạt có chứa cácbon trong plasma. Đặc trưng chủ yếu là C+, ngoài ra CO+, CO2+, C2+ và ArC+ cũng có thể đóng một vai trò nhất định[27].
Ảnh hưởng nồng độ cácbon
Khảo sát các dung dịch chứa cácbon 5 và 30 g /l từ glycerol được đo bằng ICP-MS (Agilent 7700X). Cường độ tín hiệu của chất phân tích thu được trong dung dịch chứa cácbon được so sánh với dung dịch đối chứng là H2O deion. Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 1.5 bên dưới.
Các nguyên tố nằm trên vạch có sự tăng cường tín hiệu khi có mặt cácbon, các ngun tố nằm dưới vạch có sự giảm tín hiệu khi có mặt cácbon[27].
Hình 1.5. Cường độ tín hiệu thu được cho 5 g/l và 20 g/l dung dịch chứa cácbon so với dung dịch tương ứng khơng có cácbon cho các nguyên tố khác nhau so với năng
Ảnh hưởng tạo sol khí
Các hiệu ứng cácbon có sự ảnh hưởng trong việc tạo ra sol khí và vận chuyển ion trong plasma[50]. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu trước đây về vấn đề này chủ yếu nghiên cứu trên các dung môi dễ bay hơi. Việc so sánh ảnh hưởng giữa dung mơi có chứa cácbon và nước deion đối với q trình tạo sol khí khó khăn do ảnh hưởng nhiều yếu tố liên quan. Các mối liên hệ vật lý (tức là sức căng bề mặt, mật độ và độ nhớt) của các dung mơi (ví dụ glycerol, metanol, acetic axit, và amoni axetat) liên quan đến việc tạo sol khí và q trình vận chuyển lên plasma khơng bị ảnh hưởng bởi cácbon có trong dung mơi[65].
Khơng có sự khác biệt về tín hiệu, liên quan đến phân bố kích thước giọt sol khí ,dịng khí và dung dịch khí dung được sử dụng. Vì vậy, các hiệu ứng trong hình 5 khơng thể được quy cho những thay đổi trong các đặc tính sol khí gây ra bởi cácbon[27].
Ảnh hưởng điều kiện plasma
Để đánh giá ảnh hưởng của cácbon đối với plasma, tín hiệu 38Ar+ đã được đo bởi thiết bị Q-ICP-MS. Khi tăng hàm lượng cácbon từ 0 đến 20 g/l, tín hiệu 38Ar+
giảm trung bình 2 lần, bất kể điều kiện thử nghiệm được chọn[74]. Nguyên nhân do các phân tử hữu cơ đòi hỏi nhiều năng lượng hơn cho quá trình tạo nguyên tử khi so sánh với nước deion và do đó có ít năng lượng hơn cho việc ion hóa ngun tố phân tích. Điều này có thể giải thích cho sự giảm tín hiệu cho hầu hết các yếu tố nghiên cứu (Rb, Ba, Li, U, Sc, Mo, Pb, Mn, W, Co, B, Pd, Os, Pt, Ir, Cd, Be, Zn và S), nhưng nó khơng giải thích được tại sao cường độ tín hiệu cho Sb, Te, Au, Se, Se, Hg, I và P được tăng cường bởi cácbon. Trong thực tế, do năng lượng ion hóa cao của các nguyên tố này, tín hiệu của chúng phải bị ức chế ở mức độ lớn hơn các tín hiệu của nguyên tố có năng lượng ion hóa thấp hơn[27,40].
Ảnh hưởng điều kiện thí nghiệm
Các điều kiện như: tốc độ dịng khí Qg, cơng suất nguồn plasma, tốc độ bơm mẫu Ql, dung môi chứa cácbon gây ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu Se đã được nghiên cứu. Ảnh hưởng của Qg đối với cường độ 78Se+ và 82Se+ được đo trong dung
dịch 1% MeOH, 2% MeOH và 1% HNO3. Giá trị công suất và giá trị Qq được thể hiện trong hình 1.6. Những yếu tố này gây ảnh hưởng khác nhau đến nguyên tố phân tích[74].
Hình 1.6. Ảnh hưởng của Qg đối với cường độ tín hiệu 82Se+ với 1% MeOH, 1%HNO3 và 2%MeOH công suất 1150 W, Ql 0,5 ml/phút.
Từ hình 6 Qg tối ưu phụ thuộc vào tín hiệu và các điều kiện thử nghiệm. Khi cố định nồng độ cácbon trong plasma, thì giá trị Qg tối ưu cho 82Se+ là 2% MeOH, bất kể điều kiện thử nghiệm được thử nghiệm. Nguyên nhân được giải thích do hiệu ứng làm mát của cácbon trong buồng plasma. Bên cạnh đó cường độ tín hiệu tăng phụ thuộc vào (tốc độ bơm mẫu Ql) lượng cácbon đưa vào plasma. Cường độ tín hiệu tối đa thu được cho 82Se+ tại: tốc độ bơm mẫu Ql =0,5 ml/phút (với Qg 0,4 ml/phút) là 1,56.104.
Ảnh hưởng cơ chế ion hóa
Hiệu ứng cácbon tạo ra sự tăng cường tín hiệu cho các ngun tố khó ion hóa với những thay đổi trong mật độ ion phân tích do sự chuyển điện tích từ C + có trong plasma. Dựa trên sự chuyển tải điện tích giữa ngun tử đã ion hóa (X+) và ngun tử phân tích (M), dẫn đến ion phân tích chuyển sang trạng thái kích thích (M +*)[27].
Để nghiên cứu phản ứng chuyển tải điện tích dựa trên cácbon, bắt buộc phải đánh giá chất phân tích có chứa cácbon hiện diện trong plasma. Vì vậy dung dịch glycerol 20 g/l được sử dụng để đo.
Tín hiệu cao nhất được quan sát ứng với C+, tiếp theo là C2+ và ArC+. Tín hiệu của C+ cao gấp 1000 lần so với C2+ và ArC+. Hai mảnh ion CO+ và CO2+ không gây ảnh hưởng đến tín hiệu Se. Kết quả này cho thấy rằng C+ là mảnh cácbon quyết định hiệu ứng tín hiệu cácbon. C2+ và ArC+ ít ảnh hưởng hơn so với C+ do sự phổ biến của chúng thấp hơn[27].
Phản ứng chuyển điện tích giữa các mảnh chứa cácbon và các nguyên tố khó ion hóa đã được nghiên cứu, kết quả thể hiện ở bảng 1.7.
Bảng 1.7. Xác suất phản ứng chuyển điện tích giữa các mảnh có chứa cácbon và các ngun tố khó ion hóa.
Dựa trên các kết quả được trình bày trong bảng 1.7, rõ ràng là các nguyên tố được tăng cường tín hiệu khí có mặt cácbon (Sb, Te, Au, Se, Se, I, Hg và P) có thể
C+ CO+ CO2+ C2+ ArC+ B x Pd x x x x Os x x x x x Sb x x x Pt x x x x x Ir x x x x x Cd x x x x x Te x x x x Au x x x Be x Zn Se x x x As x x S x x x x x Hg x x I x x x x x P x x x x x x x x x x x x Tín hiệu quan sát thấy trong ICP-MS
tham gia vào các phản ứng chuyển giao điện tích với C+, cũng như với các mảnh chứa cácbon khác (ít phổ biến hơn). Vì vậy, sự tăng cường tín hiệu cho Se được giải thích là do sự truyền tải điện từ C+, C2+ và ArC+ trong khi tất cả các mảnh có chứa cácbon nghiên cứu đều có thể đóng vai trị trong việc tăng cường tín hiệu cho Se [65].
1.4. Một số cơng trình phân tích dạng Se ở Việt Nam và trên Thế Giới
Trong những năm đầu thế kỷ 20, có nhiều thơng báo về tác hại của các hợp chất của selen đối với sức khoẻ con người và động vật. Việc phát hiện ra selen là nguyên nhân chính gây bệnh kiềm ở động vật ăn cỏ đã khẳng định thêm độc tính cao của selen. Súc vật ăn cỏ có chứa selen ở nồng độ cao có thể bị què, hay cá biệt có những trường hợp bị tử vong.
Đặc tính sinh học của selen chỉ được chú ý do độc tính cao của nó. Selen chính là ngun nhân gây què và tử vong các động vật ăn cỏ sống ở vùng DakotSe và Wyomine (Franke, 1834). Một số các triệu chứng điển hình ở ngựa được Nadison và những người khác (1860) miêu tả như rụng lơng đi, lơng bờm, phù xương móng dẫn đến viêm móng và rụng móng[12].
Tiếp theo đó, một loạt các cơng trình khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ các tác dụng của selen trên cơ thể con người và động vật được tiến hành. Đến năm 1960, người ta đã chính thức thừa nhận các tác dụng có lợi của selen, coi nó là một nguyên tố vi lượng thiết yếu cho người và động vật. Ngoài ra, người ta cũng nghiên cứu hiệu quả của selen trong phòng ngừa và điều trị một số bệnh như ung thư, tim mạch, lão hoá...[66,67].
Đến ngày nay phân tích dạng selen đã phát triển lên những tầm cao mới cả về phương pháp lẫn khả năng phát hiện lượng vết dạng selen. Trên thế giới có nhiều cơng trình nghiên cứu dạng selen liên quan đến thực phẩm giàu selen, một số loại thuốc, nấm men, rong biển và hạt cây. Điển hình như S.S. Kannamkumarath và CCS đã định lượng các dạng selen trong một số loại hạt(2002)[61], P. Moreno và CCS đã nghiên cứu thành công dạng selen trong mẫu sinh học(2003)[52], NicholSe V.C. Ralston và CCS(2010)[47] cùng E. G. Da Silva và CCS(2013) đã có bài đăng về phân
tích dạng selen sử dụng kỹ thuật ghép nối HPLC-ICP-MS[22]. Cùng phương pháp này M. Tie và CCS đã có nghiên cứu phân tích dạng Se trong nấm[46].
Tại Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu về đặc tính điện hố, đặc tính quang hố của các dạng selen. Điển hình như Lê Thị Duyên đã có nghiên cứu định dạng selen bằng phương pháp von-ampe hoà tan sử dụng điện cực HMDE(2012)[2], Nguyễn Thị Thúy Hằng có đề tài phân tích dạng selen trong nước ngầm bằng phương pháp động học xúc tác trắc quang(2011),…[4]
Từ những khía cạnh có lợi của selen , người ta đã ứng dụng và sản xuất các loại thuốc chữa bệnh có chứa selen. Điển hình trên thị trường hiện nay có các loại thuốc chứa Selen điều chế từ Selen hữu cơ có trong nấm men: Belaf, Youngton, Saylom, Binacle, Cigelton, Colaf, Neoselen, Selazn, Centrum,…
1.5. Kết luận
Nội dung chương 1 đã làm rõ được đặc tính sinh, hố của Se, các dạng tồn tại của nó trong tự nhiên và trong các mơi trường cũng như vai trị của Se là cần thiết đối với sự phát triển bình thường của cơ thể con người.
Đã tìm hiểu và phân tích được các phương pháp phân tích tổng Se cũng như đã phân tích, đánh giá và lựa chọn được phương pháp phân tích dạng Se để áp dụng trong nghiên cứu này.
Đã làm rõ, giải thích được một số yếu tố ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu Se trong ICP-MS như: nồng độ cácbon đi vào plasma, khí Ar tạo sol khí trong nebuziler, điều kiện thí nghiệm và cơ chế ion hố. Trong đó thành phần pha động chứa cácbon gây ảnh hưởng lớn nhất đến cường độ tín hiệu Se.
Nêu bật được một số cơng trình nghiên cứu phân tích dạng Se ở trong và ngồi nước. Trình bày được lý do vì sao phải phân tích dạng Se, một số dạng có hoạt tính sinh học có lợi và một số dạng khác lại có độc tính cao.
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 2.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích: Chất gốc natri selenit (Na2SeO3) (99%, Merck, Singapore)
Chất gốc seleno-DL-methionine (C5H11NO2Se) (99%, Merck, Singapore)
Chất gốc seMethyl-selen ocystein hydrochloride (C4H9NO2Se.HCl) (99%, Merck, Singapore)
Chất gốc natri selenate decahydrate (Na2SeO4.10H2O) (99,999%, Merck, Singapore) Chất chuẩn Se (VI) (99,9%, Merck, Singapore)
Dung môi methanol (MeOH) (99,9%, Merck, Singapore) Muối amoni axetat (CH3COONH4) (99,9%, Merck, Singapore)
Etylendiamintetraacetic axit muối 2 lần natri (EDTA-Na2) (99%, Merck, Singapore) Dung dịch axit sulfuric, H2SO4 (98%, Merck, Singapore)
Dung dịch axit nitric, HNO3 (69-71%, Merck, Singapore) Dung dịch axit clohidric, HCl (36,5-38%, Merck, Singapore) Dung dịch H2O2 (30%, Korea)
Dung dịch axit photphoric H3PO4 (85-87%, Merck, Singapore) Muối dikali photphat K2HPO4 (99,9%, Merck, Singapore) Muối natri clorua, NaCl (99,9%, Merck, Singapore) Muối kali clorua, KCl (99,9%, Merck, Singapore) Natri hiđroxit, NaOH (99,9%, Merck, Singapore) Dung dịch NaOH 4M, dung dịch HCl 4M
Dung dịch đệm photphat(PBS)
Dung dịch amoniac 5%, NH4OH (25%, Merck, Singapore) Dung dịch axit axetic 5% (99%, Merck, Singapore)
Pha các dung dịch chuẩn
Pha dung dịch chuẩn gốc Se (VI) 1000ppm, SeMeCys 1000ppm, Se (IV) 1000 ppm, Se-DLMet 1000ppm. Thêm khối lượng cân (bảng 2.1) vào các bình định mức
10 ml riêng rẽ, định mức tới 10ml bằng nước đề ion. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản trong tủ lạnh ở -180C, sử dụng trong vòng 03 tháng.
Bảng 2.1. Bảng pha dung dịch chuẩn gốc
Hóa chất CTPT Mnhãn P% Vml m(mg) Cppm
Sodium Selenit Na2SeO3 172,94 99% 10 22,12 1000 Seleno-DL- methionine C5H11NO2Se 196,11 99% 10 25,08 1000 Se-(Methyl) selenocystein hydrochloride C4H9NO2Se.HCl 218,54 95% 10 29,14 1000 Sodium Selenate decahydrate Na2SeO4.10H2O 369,09 99,999% 10 46,74 1000
Pha dung dịch chuẩn trung gian các dạng Se 10ppm: Hút chính xác 1ml mỗi dung dịch chuẩn gốc Se 1000ppm bằng micropipet 100-1000µl, cho vào các bình định mức 100ml riêng rẽ, định mức đến 100ml bằng nước đề ion. Tương tự pha dung dịch chuẩn trung gian của dung dịch chuẩn 4 dạng Se 10ppm (phục vụ việc dựng đường chuẩn).
Pha dung dịch làm việc: Từ dung dịch chuẩn trung gian của 4 dạng Se 10ppm, pha các dung dịch làm việc của dung dịch chuẩn 4 dạng Se có nồng độ lần lượt là 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ppb vào các bình định mức 25 ml, định mức bằng nước đề ion đến 25 ml.
Pha pha động: Cân chính xác 1,9663g CH3COONH4 vào lọ thủy tinh đựng pha động thể tích 1 lít, thêm 0,1 g EDTA thu được dung dịch CH3COONH4 với nồng độ 25 mM. Chỉnh pH=8 bằng NH3 5% và CH3COOH 5%. Cân chính xác 19,6632g CH3COONH4 vào lọ thủy tinh đựng pha động thể tích 1 lít, thêm 0,1 g EDTA thu