CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân tích các dạng Se có trong một số mẫu thuốc và nấm men như phương pháp điện hóa, phương pháp quang học, HPLC kết nối với các detector thích hợp (UV-Vis, PDA, ICP-MS, MS,…). Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ghép nối plasma cao tần là phương pháp hiện đại nhất, độ nhạy và độ chọn lọc cao. Chính vì thế nên chúng tơi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-ICP-MS để phân tích 4 dạng Se (VI), Se (IV), Se- DLMet và SeMeCys, đây đều là những dạng Se có hoạt tính sinh học thường có mặt trong các sản phẩm thuộc về dược (thuốc, vitamin, thực phẩm chức năng). Cơ sở của phương pháp nghiên cứu là dựa trên khả năng tách các dạng Se trên cột sắc kí. Sau đó từng dạng selen đã tách được phát hiện trên thiết bị ICP-MS.
2.2.2. Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu
Mẫu thuốc nghiên cứu đều có chứa một dạng Se ghi trên thành phần thuốc. Ngồi ra, các mẫu thuốc trong nghiên cứu này có thành phần hữu cơ như β-Caroten,
vitamin E và C, một số vi khoáng kim loại Fe, Mn, Na, K, Mg, Ca, Zn,…Với thành phần nền mẫu thuốc phức tạp cũng như thành phần sinh học kiểu tế bào ở dạng nấm men có khả năng lưu giữ, cố định Se mạnh đòi hỏi phương pháp tách chiết mẫu phải đảm bảo dung mơi có sự đẳng trương và pH giống với máu người để đảm bảo hoạt tính sinh học của dạng Se không bị ảnh hưởng quá lớn gây nhiễu kết quả phân tích.
Mẫu thuốc sau khi mua được bảo quản ở nhiệt độ phòng 250C, mẫu nấm men giàu selen được bảo quản trong tủ lạnh -180C trước khi được xử lý. Cân 50 mg mỗi mẫu nấm men và thuốc (đã được nghiền nhỏ đối với viên nén hoặc tách phần ruột đối với viên dạng gel). Pha loãng trong 5ml PBS trước khi thêm 1ml NaOH 4M. Ủ trong tủ sấy ở 95oC trong 5 phút, sau đó thêm vào 4ml HCl 0,8 M. Ly tâm 10 phút với tốc độ 10000 vòng/phút, gạn lọc lấy phần dung dịch đồng nhất và bảo quản ở -180C trước khi phân tích trên hệ thống HPLC-ICP-MS.
2.2.3. Phương pháp phân tích mẫu Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu:
4 dạng của Se gồm: Selenate (SeVI), Selenite (SeIV), Seleno-DL-methionine (Se-DLMet) và Se-Methyl-Selenocystine (SeMeCys) trong một số mẫu dược phẩm và nấm men.
Selenate : SeO42- (H2SeO4, pKa1= 2,5; pKa2= 7,3) Selenite: SeO32- (pKa1= -3, pKa2= 1,9)
Seleno-DL-methionine: H3N+-CH(COO–)-CH2-CH2-Se-Me (pKa1=1,6; pKa2= 9,5) Se-Methyl-Selenocystine: H3N+-CH(COO–)-CH2-Se-Me (pKa1=1,5; pKa2= 8,4)
Các mẫu thực trong nghiên cứu gồm: nấm men giàu Se (định hướng làm thực phẩm chức năng) và một số thuốc bổ sung Se có tác dụng ngăn ngừa lão hóa và tốt cho tim mạch (thuốc Colaf, thuốc Selazn và thuốc Centrum ).
Nội dung nghiên cứu:
Xây dựng quy trình phân tích một số dạng Se gồm SeMeCys, Se (IV), Se- DLMet và Se (VI) trên hệ thống HPLC-ICP-MS
Xác định tổng hàm lượng Se, định tính và định lượng từng dạng Se trong mẫu nấm men và mẫu thuốc.
Quy trình phân tích
Khảo sát các điều kiện xác định cường độ tín hiệu Se trên hệ thống ICP-MS Khảo sát các điều kiện tối ưu khả năng tách trên hệ thống HPLC
Đánh giá phương pháp phân tích dựa trên hệ liên hợp HPLC-ICP-MS Áp dụng vào phân tích mẫu thuốc, TPCN, nấm men