STT Dạng selen
Phương trình hồi quy biểu diễn tương quan tín hiệu phân tích của 4 dạng Se phụ thuộc vào nồng độ
Có sử dụng nội chuẩn Khơng sử dụng nội chuẩn
Phương trình hồi quy R2 Phương trình hồi quy R2
1 SeMeCys Y=(0,010±9,6.10-5)*X + (0,120±0,0269) 0,9995 Y=(594±17)*X ̶ (9125±4896) 0,9957 2 Se (IV) Y=(0,027±5,4.10-4)*X + (0,420±0,151) 0,9980 Y=(1570±75)*X ̶ (48734,4±21147) 0,9887 3 Se-DLMet Y=(0,063±8,98.10-4)*X ̶ (0,027±0,252) 0,9990 Y=(4304±218)*X ̶ (173297,8±61534) 0,9872 4 Se (VI) Y=(0,067±11,25.10-4)*X+(0,392±0,253) 0,9989 Y=(4432±197)*X ̶ (117123±55511) 0,9902
Như chỉ ra trong bảng 3.9, hệ số tương quan R2 trong phương trình hồi quy có sử dụng nội chuẩn tốt hơn so với không sử dụng nội chuẩn. Do đó, nội chuẩn sẽ được sử dụng để định lượng các dạng selen trong mẫu thực. Dựa vào kết quả của phương trình hồi quy tuyến tính của SeMeCys, Se (IV), Se-DLMet và Se (VI) ta thấy các phương trình đều có hệ số tương quan R2 > 0.995. Như vậy khi xác định được diện tích pic của một dạng Se thì ta sẽ tính ra được nồng độ của nó với độ chính xác lớn hơn 99,5%.
Đồ thị biểu diễn sự tương quan tín hiệu phân tích vào nồng độ các dạng Se trong mẫu được đưa ra trong phụ lục 1.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phép đo được
tính dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (N), trong đó LOD được định nghĩa là 3*S/N trong khi đó LOQ được tính là 10*S/N theo như hướng dẫn của Elvar Theodorsson và đồng nghiệp[23].
Tiến hành tính tốn LOD và LOQ của phương pháp dựa trên việc đo chuẩn 4 dạng Se ở nồng độ 25ppb cho Se-DLMet, Se (VI) và 100ppb với SeMeCys, Se (IV). Các thông số quan trọng khác của phép phân tích như khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác của phép đo được đưa ra trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Các đại lượng đặc trưng của phép phân tích các dạng Se bằng phương pháp HPLC-ICP-MS TT Chất phân tích tR phút (TB) %RSD LOD ng/ml LOQ ng/ml Khoảng tuyến tính ng/ml 1 SeMeCys 7,8 5,56 18,75 62,5 50-500 2 Se (IV) 12,80 1,88 75,0 250,0 100-500 3 Se-DLMet 14,51 0,72 15,0 50,0 25-500 4 Se (VI) 18,43 0,26 3,3 10,9 25-400
Thời gian lưu của từng dạng Se ổn định với sai số tương quan % RSD từ 0,26 đến 5,56% cho thấy phương pháp phân tích có độ chính xác, độ ổn định và tính đúng.
3.1.4. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị
Một thơng số quan trọng khác của phương pháp phân tích là độ ổn định của phép đo. Nó thể hiện qua độ lặp lại của kết quả phân tích. Để đánh giá độ ổn định của thời gian lưu và tín hiệu phân tích. Năm dung dịch chuẩn chứa đồng thời bốn dạng Se nồng độ 100 ppb tính theo Se được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc trong nước deion. Dung dịch chuẩn này được bơm vào hệ thống HPLC-ICP-MS có sử dụng bộ bơm mẫu sau cột ở điều kiện tối ưu. Dung dịch chuẩn Se (VI) (Merck) nồng độ 100 ppb trong dung dịch HNO3 2% được sử dụng làm nội chuẩn và bơm vào hệ thống qua van bơm mẫu sau cột tách. Số liệu được xử lý trên phần mềm Xcalibur version 2.1 của Thermo Scientific. Diện tích píc của các dạng Se tương ứng và của nội chuẩn được lấy tích phân kế trên chức năng QuanBrowser tích hợp trong Xcalibur. Tỉ số diện tích pic được tính bằng cách lấy diện tích pic của các dạng selen chia cho diện tích của pic nội chuẩn. Kết quả về diện tích pic và tỉ số diện tích pic được trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Độ lặp lại của tín hiệu phân tích khi có và khơng sử dụng nội chuẩn
Diện tích pic (khơng sử dụng nội chuẩn)
Dạng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 RSD(%)
SeMeCys 41243 41309 46828 50499 43215 8,95 Se (IV) 113714 117853 142727 147473 121647 11,92 Se-DLMet 188990 160239 212308 197201 187234 10,03 Se (VI) 263786 275504 290605 301274 269076 5,55
Tỷ số diện tích pic (sử dụng nội chuẩn)
Dạng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 RSD(%)
SeMeCys 1,146 1,105 1,059 1,108 1,100 2,80
Se (IV) 3,159 3,151 3,229 3,236 3,097 1,83
Se-DLMet 4,855 4,285 4,803 4,327 4,766 6,02
Sắc đồ lặp lại của 5 lần phân tích hỗn hợp bốn dạng selen nồng độ 100ppb được đưa ra trong hình 3.17.
Hình 3.17. Sắc đồ phân tích của năm lần bơm mẫu lặp lại có sử dụng van bơm mẫu sau cột để bơm nội chuẩn vào hệ thống. Pha động bao gồm CH3COONH4 25mM;250mM; pH 8,0; 2% MeOH với chương trình gradient pha động. Thể tích mẫu của cả hai vịng bơm mẫu là 100µL. Pic đầu tiên trên sắc đồ là của nội chuẩn được bơm bằng van bơm mẫu sau cột.
Như có thể thấy trong bảng 3.11, phương pháp sử dụng nội chuẩn có độ lặp lại tốt cho đồng thời cả 4 dạng tồn tại của Se. Độ lệch chuẩn tương đối vể tỉ số diện tích píc cho thấy khả năng lặp lại tốt về tín hiệu phân tích của các dạng Se. Độ lệch chuẩn tương đối nằm trong khoảng từ 1,83 % (Se IV) đến 6,02% (Se-DLMet). Trong khi đó nếu khơng sử dụng nội chuẩn thì độ lệch chuẩn tương đối nằm trong khoảng 5,55 đến 11,92%. So sánh về độ lệch chuẩn tương đối giữa hai phương pháp có và khơng sử dụng nội chuẩn nhận thấy rằng nếu khơng sử dụng nội chuẩn thì %RSD cao hơn rất nhiều (cao hơn khoảng 1-5 lần). Điều này được lý giải do sự không ổn định của nguồn plasma cao tần cảm ứng trong quá trình bơm mẫu vào hệ thống HPLC-
RT:0,00 - 25,23 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time (min) 0 10000 20000 0 10000 20000 0 10000 20000 Int en s it y 0 10000 20000 0 10000 20000 18,35 14,53 0,98 14,72 18,76 8,53 1,18 2,49 5,00 5,767,91 9,08 9,92 12,28 15,98 19,83 22,78 24,25 18,39 0,85 14,26 18,65 14,47 1,00 6,83 7,40 8,05 12,32 14,03 19,53 8,77 2,44 6,36 17,64 23,38 24,56 18,46 0,76 14,30 14,55 1,05 2,13 5,62 6,76 7,09 7,71 11,47 11,98 15,95 18,84 19,96 22,09 23,95 18,43 0,93 14,38 14,73 18,76 1,18 2,07 6,206,99 7,57 7,99 11,57 14,09 16,23 3,02 20,85 23,02 24,11 18,46 0,79 14,36 0,86 7,20 7,38 7,81 12,51 14,59 18,84 11,99 1,40 5,47 16,52 21,45 23,15 24,46 NL: 2,19E4 m/z= 77,00-83,00 MS std100pbbL1 NL: 2,09E4 m/z= 77,00-83,00 MS std100pbbl2 NL: 2,22E4 m/z= 77,00-83,00 MS std100pbbl3 NL: 2,09E4 m/z= 77,00-83,00 MS std100pbbl4 NL: 2,10E4 m/z= 77,00-83,00 MS std100pbbl5 Nội chuẩn Se(VI) SeCys Se(IV) Se-DLMet Se(VI)
ICP-MS. Đây cũng là một nhược điểm chính của detector ICP-MS trong phân tích dạng tồn tại của chất. Tuy nhiên, điều này được khắc phục nếu sử dụng nội chuẩn thích hợp trong q trình phân tích. Nội chuẩn sẽ bổ chính và bù trừ mọi thay đổi trong q trình xử lý mẫu, đo tín hiệu phân tích. Thơng thường để thực hiện được việc bổ chính và hiệu chỉnh này, các chất nội chuẩn đồng vị của chính chất cần phân tích được sử dụng (species-specific internal standard) thực hiện kỹ thuật phân tích pha lỗng đồng vị khối phổ (ID-MS). Nhưng để sử dụng phương pháp nội chuẩn này thì ngun tố cần phân tích phải có ít nhất hai đồng vị bền. Trong thực tế, selen chỉ có duy nhất một đồng vị bền. Do đó việc sử dụng kỹ thuật ID-MS là không khả thi. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chất nội chuẩn khơng đặc trưng chứa chính ngun tố Se trong phân tử (species-unspecific internal standard) được sử dụng kèm theo bộ bơm mẫu sau cột. Mặc dù việc sử dụng chất nội chuẩn không đặc trưng (trong nghiên cứu này là Se (VI)) chỉ có thể bổ chính và bù trừ ở giai đoạn cuối của qui trình phân tích (trong giai đoạn đo HPLC-ICP-MS) không bao gồm giai đoạn xử lý mẫu. Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng việc sử dụng chất nội chuẩn cho độ lặp lại của tín hiệu phân tích cao hơn (bảng 3.11). Do đó nội chuẩn khơng đặc trưng được khuyến cáo sử dụng trong phân tích HPLC-ICP-MS, đặc biệt là đối với các nguyên tố chỉ có duy nhất một đồng vị bền. Trong nghiên cứu này, Se (VI) kết hợp với van bơm mẫu sau cột được sử dụng là nội chuẩn cho phép định lượng các dạng selen trong các đối tượng mẫu thực phẩm.
3.1.5. Độ thu hồi
Hiệu suất thu hồi (H%) của phương pháp được xác định bằng cách thêm một lượng chuẩn đã biết vào nền mẫu thật khơng chứa chất phân tích. Chọn một mẫu thuốc bất kỳ có dạng tương tự mẫu phân tích (mẫu trắng), với điều kiện là khơng chứa Se (xác thực bằng việc đo tổng hàm lượng với ICP-MS). Sau đó thêm vào chuẩn Hỗn hợp Se 4 dạng 100ppb, rồi đi chiết với các điều kiện như đối với mẫu thực. Đem dung dịch chiết đi đo dạng trên hệ thống HPLC-ICP-MS, đo lặp lại 5 lần với nội chuẩn Se (VI) 100ppb. Kết quả thu được trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả đo độ lặp lại của mẫu trắng thêm chuẩn 100ppb
Dạng Se Lần đo Nồng độ thêm vào
(ppb) Nồng độ đo được (ppb) Hiệu suất thu hồi(%) SeMeCys 1 100 115,7 115,7 2 100 101,5 101,5 3 100 94,6 94,6 4 100 88,9 88,9 5 100 107,7 107,7 TB - 101,7 101,7±10,6 Se (IV) 1 100 72,6 72,6 2 100 71,5 71,5 3 100 76,0 76,0 4 100 73,3 73,3 5 100 74,1 74,1 TB - 73,5 73,5±1,7 Se-DLMet 1 100 83,5 83,5 2 100 70,1 70,1 3 100 76,5 76,5 4 100 70,9 70,9 5 100 74,3 74,3 TB - 75,04 75,1±5,4 Se (VI) 1 100 118,3 118,3 2 100 102,1 102,1 3 100 92,3 92,3 4 100 87,2 87,2 5 100 96,4 96,4 TB - 99,26 99,3±11,9
Kết quả thu được trên bảng 3.12 cho thấy sự tách các dạng Se có độ lặp lại tốt và có độ thu hồi nằm trong khoảng 73,5% đến 101,7%. Kết quả này nằm trong khoảng 70% - 120% và là kết quả hoàn toàn chấp nhận được. Sắc đồ độ thu hồi 4 dạng Se bằng phương pháp thêm chuẩn được thể hiện ở phụ lục 2.
3.2 Kết quả phân tích định lượng dạng selen trong mẫu dược phẩm và thực phẩm chức năng giàu selen phẩm chức năng giàu selen
3.2.1. Hàm lượng selen tổng số
Hàm lượng Se tổng số được xác định bằng quy trình đo tổng Se trên máy ICP- MS Elan 9000 của hãng Perkin Elmer. Kết quả xác định tổng hàm lượng Se trên ICP- MS được thống kê trong bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả đo tổng hàm lượng Se có mặt trong mẫu thực
Mẫu thuốc Lượng cân
(mg) Vđm (ml) Hàm lượng tính được C(µg/g) Hàm lượng ghi trên nhãn (µg/viên) Nấm men 51,8 10 231,7 - Selazn 58,3 10 5,7 92,6 Colaf 50,2 10 2,3 50,0 Centrum 53,5 10 35,8 55,0 TPCN 66,8 10 20,2 200
Tổng hàm lượng Se trong các mẫu thuốc từ 2,27 đến 35,76 µg/g, đối với mẫu nấm men thì hàm lượng cao hơn, khoảng 232 µg/g. Chúng tơi khơng tiến hành so sánh giữa hàm lượng tuyệt đối và hàm lượng Se có trong 1 viên thuốc như ghi trên nhãn thuốc nhằm tránh mọi vấn đề pháp lý xảy ra. Bảng trên nhằm chỉ ra các loại thuốc có chứa hàm lượng Se được cơng bố và hàm lượng phép phân tích tổng để so sánh với với phép phân tích dạng Se được trình bày trong bảng 3.14.
3.2.2. Hàm lượng các dạng selen
Trong mẫu thuốc, TPCN và nấm men tồn tại các dạng Se khác nhau. Chúng được tách ra khỏi mẫu bằng quy trình chiết với đệm PBS+NaOH đã tối ưu hoá và được xác định trên hệ HPLC-ICP-MS.
Tiến hành phân tích dạng Se có trong các mẫu thử nghiệm đã cho kết quả khả quan. Trong mẫu nấm men tồn tại dạng Se-DLMet với hàm lượng khá lớn. Trong mẫu thuốc Selazn, có hai dạng Se được phát hiện nhưng khơng có trong 4 dạng Se đã khảo sát. Trong mẫu thuốc Colaf cũng xác nhận sự có mặt của 1 dạng Selen khơng thuộc 4 dạng Se trong nghiên cứu này. Trong mẫu thuốc Centrum có dạng Se (VI) với píc sắc ký rõ ràng và hàm lượng tương đối lớn. Trong mẫu thực phẩm chức năng đã xác định và định lượng được hai dạng Se là Se-DLMet và Se (VI).
Qua phân tích hàm lượng Se trong một số mẫu thuốc và nấm men, ta thu được kết quả hàm lượng Se qua các bảng trên. SeMeCys là một dạng của Se có tác dụng chống lão hóa và ngăn ngừa một số bệnh về tim mạch… Cũng chính vì lí do đó, trong các thuốc nghiên cứu hầu như đều chứa SeMeCys. Trong thuốc, Se chiếm một lượng rất nhỏ (trong khoảng từ 16,77 µg/g đến 35,36 µg/g), cịn trong nấm men thì hàm lượng Se cao hơn (~110 µg/g ). Mặc dù chỉ chiếm hàm lượng nhỏ, nhưng sự có mặt của Se trong thành phần thuốc cũng góp ích cho sự chống lão hóa tế bào và phịng chống các căn bệnh nguy hiểm. Vì vậy, con người nên bổ sung lượng Se cần thiết cho cơ thể thông qua việc sử dụng thuốc hoặc vitamin có chứa Se, hoặc thơng qua ăn uống dinh dưỡng hàng ngày. Kết quả phân tích dạng Se được thể hiện trong bảng 3.14. Sắc đồ phân tích dạng Se được thể hiện trong phụ lục 3.
Bảng 3.14. Kết quả tổng hợp các dạng selen có trong mẫu thuốc, TPCN và nấm men có sử dụng nội chuẩn STT Dạng Se Nấm men (µg/g) Sezlan (µg/g) Colaf (µg/g) Centrum (µg/g) TPCN (µg/g) 1 SeMeCys nd nd nd 35,4 nd 2 Se (IV) 108,3 nd nd nd nd 3 Se-DLMet nd nd nd nd 8,7 4 Se (VI) nd nd nd nd 8,1 Tổng* 108,3 - - 35,4 16,8 Hàm lượng đo tổng 231,7 5,73 2,3 35,8 20,2
Tổng* là hàm lượng các dạng Se trong mẫu phân tích bằng hệ ghép nối HPLC-ICP-MS Hàm lượng đo tổng là tổng Se trong mẫu khi đo bằng ICP-MS
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Trên cơ sở nghiên cứu khả năng tách 4 dạng Se là SeMeCys, Se (IV), Se- DLMet và Se (VI) bằng cột sắc ký trao đổi anion và phát hiện trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ghép nối ICP-MS, chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau:
1. Tối ưu hoá các điều kiện tách 4 dạng Se trên cột tách sắc ký trao đổi anion mạnh sử dụng pha động gồm amoni acetat, EDTA và MeOH. Điều kiện tối ưu thu được cho sự tách 4 dạng Se là: tốc độ pha động 0,5ml/phút, MeOH 2%, EDTA 0,01%, CH3COONH4 2 kênh nồng độ 25mM và 250mM.
2. Tối ưu các điều kiện nhận biết Se trên ICP-MS bao gồm các thông số công suất nguồn plasma 1250W, tốc độ khí tạo sol 1,05 L/phút, thế của thấu kính ion 10V.
3. Thành phần pha động làm giảm tín hiệu Se khoảng 4 lần so với trong nước deion khi ở cùng điều kiện phân tích tối ưu.
4. Đánh giá các thơng số đặc trưng của phương pháp phân tích dựa trên hệ ghép nối HPLC-ICP-MS như: khoảng tuyến tính (Linearity), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ),…Với kết quả chỉ ra rằng sử dụng nội chuẩn tốt hơn không sử dụng nội chuẩn. LOD của 4 dạng Se gồm SeCys, Se (IV), Se-DLMet, Se (VI) lần lượt là 18,7 ng/ml, 75,0 ng/ml, 15,0 ng/ml, 3,3 ng/ml ; LOQ lần lượt là 62,5 ng/ml, 250,0 ng/ml, 50,0 ng/ml, 10,9 ng/ml. 5. Đã chọn được dung mơi thích hợp là 5 ml PBS + 1ml NaOH để chiết các dạng
Se ra khỏi nền mẫu nghiên cứu.
6. Áp dụng thành cơng phân tích, định lượng các dạng tồn tại của Se trong một mẫu thuốc (selazn, colaf, centrum), mẫu thực phẩm chức năng và mẫu nấm men giàu selen. Kết quả phân tích thu được là đáng tin cậy.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt
[1] Hoàng Thị Dung (2013), Phân tích đồng thời các dạng Dimethyldiselenite, Selenomethioline, Selenit và Selenat trong mẫu thủy hải sản, Luận văn Thạc sĩ
Hố phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội.
[2] Lê Thị Duyên (2012), Nghiên cứu xác định một số dạng selen trong hải sản bằng
phương pháp Von-Ampe hòa tan, Luận văn Tiến sĩ Khoa học, Viện hố học-
Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội.
[3] Vũ Đăng Độ, Triệu Thị Nguyệt (2010), Hố học vơ cơ – Quyển I Các nguyên tố
s và p, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, Hà Nội.
[4] Nguyễn Thị Thúy Hằng (2011), Phân tích dạng Se(IV), Se(VI) vơ cơ trong mẫu
nước ngầm và thực phẩm bằng phương pháp động học – xúc tác trắc quang,
Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐH QGHN.
[5] Lê Thị Hương Giang, Trần Chương Huyến, Nguyễn Quang Huy (2002), Cực phổ
xung vi phân xác định lượng vết selen sử dụng sóng xúc tác trong nền đệm amoni, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐH QGHN.
[6] Lê Kim Long, Hồng Nhâm (2001), Tính chất lý hố học các chất vô cơ, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 314-322.
[7] Phạm Luận (2010), “Giáo trình các phương pháp phân tích quang phổ”, Nhà xuất bản đại học Quốc Gia Hà Nội.
[8] Phạm Thuý Nga (2003), Nghiên cứu xác định Asen, Selen trong máu và nước tiểu