Nồng độ AG (µg/ml) OD765 ODtb 10 0,148 0,177 0,144 0,156 20 0,218 0,24 0,233 0,230 30 0,335 0,33 0,34 0,335 40 0,502 0,514 0,51 0,509 50 0,525 0,534 0,552 0,537 60 0,646 0,666 0,659 0,657 70 0,801 0,756 0,938 0,832 80 0,875 0,898 0,806 0,860 90 1,057 1,027 1,019 1,034 100 1,128 1,148 1,149 1,142
Phương trình đường chuẩn axit gallic là cơ sở để xác định hàm lượng Phenolic trong các mẫu dịch chiết cây Tô mộc: y = 0,011x + 0,015.
Hình 2.3. Đường chuẩn axit gallic
+ Xác định hàm lượng Phenolic trong mẫu dược liệu: Mẫu cao chiết được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau và tiến hành thí nghiệm tương tự như axit gallic. Hàm lượng Phenolic tổng số được xác định dựa trên đường chuẩn axit gallic theo công thức:
TP (mg GAE/g) = C x K x V
m x 1000
Trong đó:
TP: Hàm lượng Phenolic tổng số tương đương hàm lượng axit gallic trong 1 g mẫu thử, mg GAE/g.
C: Nồng độ Phenolic (µg/ml) tương đương axit gallic được xác định từ đường chuẩn.
K: Hệ số pha loãng
V: Thể tích định mức của dung dịch mẫu thử 1000: Hệ số quy đổi từ µg GAE/g sang mg GAE/g m: Khối lượng mẫu thô
y = 0,011x + 0,015 R² = 0,993 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hàm lượng axit gallic (µg/ml)
Đ ộ h ấ p t h ụ O D 7 6 5 n m ( A )
2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
2.2.4.1 Phương pháp khuếch tán giếng thạch (Agar well diffusion method)
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Hadacek và cộng sự, 2000) trong đó chất thử nghiệm được bổ sung vào các giếng trên đĩa thạch đã được cấy vi khuẩn để đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật của chất thử nghiệm. Khi chất đã khuếch tán đều vào môi trường nuôi cấy, các đĩa vi khuẩn được bọc kín và đem ni ở điều kiện tối ưu. Sau khoảng 18-24 giờ nuôi cấy, các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn sẽ cho thấy sự xuất hiện các vòng trịn vơ khuẩn bao quanh giếng thạch. Khả năng ức chế vi khuẩn của các chất thử nghiệm được đánh giá đựa vào kích thước vịng kháng khuẩn [10, 13].
- Vật liệu và hóa chất
+ Hóa chất pha môi trường LB nuôi cấy VSV: cao nấm men, trypton hoặc pepton, NaCl, agar,…
+ Dung dịch kháng sinh: Gentamycin; rifampicin; chloramphenicol.
+ Chuẩn bị mẫu: Cao chiết khơ được hịa tan trong DMSO 10% để thu được dung dịch có nồng độ gốc 200 mg/ml. Sau đó lọc qua màng lọc vơ trùng (lỗ màng 0,22 nm) và pha loãng thành các dung dịch có nồng độ thấp hơn để thực hiện xác hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết.
+ Dụng cụ: Tủ cấy vi khuẩn, tủ nuôi vi khuẩn, tủ ấm 37oC, máy đo quang phổ, dụng cụ đục lỗ thạch đường kính 6 mm, pipet man, đầu tip 100, 200, 1000 µl và đĩa petri thủy tinh (Φ10), đèn cồn, que cấy trải, bình tam giác, ống eppendorf.
+ Vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gram âm: E. coli ATCC 25922; S. typhimurium ATCC 14028;
P. aeruginosa ATCC 27853.
Vi khuẩn Gram dương: S. aureus ATCC 25923; B. subtilis ATCC 6633;
Vi khuẩn Vibrio: Vibrio parahaemolyticus (bao gồm các chủng VP1, VP2, VP3, VP4); Vibrio harveyi (VH).
- Quy trình thực hiện
+ Chuẩn bị mơi trường nuôi cấy vi sinh vật: Chuẩn bị môi trường LB theo công thức (phần phụ lục), đem khử trùng ở 121oC – 20 phút sau đó chuẩn bị các đĩa mơi trường LB đặc có độ dày 4 mm (tương ứng khoảng 25 ml môi trường đối với đĩa petri 10).
+ Chuẩn bị vi sinh vật:
Các chủng vi khuẩn được ni cấy kích hoạt từ ống chủng gốc trên mơi trường LB đặc qua đêm ở điều kiện tối ưu, sau đó lựa chọn một khuẩn lạc đơn để chuyển sang nuôi cấy trong 5 ml môi trường LB lỏng bằng máy lắc ủ nhiệt trong điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn.
Đo độ đục của dịch vi khuẩn bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm và điều chỉnh nồng độ vi khuẩn cho tới khi độ hấp thụ quang phổ đạt 0,08 - 0,1 (tương đương với nồng độ vi khuẩn đạt 1-2 x 108 CFU/ml).
Chuẩn bị kháng sinh làm đối chứng: Gentamycin được sử dụng cho các chủng Gram âm, rifampicin được sử dụng cho các chủng Gram dương, chloramphenycol được sử dụng cho các chủng VP và VH.
+ Tiến hành thí nghiệm:
Tiến hành cấy trải 100 µl dịch vi khuẩn (đạt nồng độ 108 CFU/ml) lên đĩa thạch đã được chuẩn bị sẵn. Sử dụng các ống có đường kính 6 mm để tạo các giếng trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn. Lần lượt bổ sung 1 thể tích mẫu phù hợp vào các giếng, sau đó ủ các đĩa ở nhiệt độ 4-8oC trong vịng 2 - 4 giờ để mẫu có thể khuếch tán, đồng thời ngăn sự phát triển của vi khuẩn khi các chất chưa khuếch tán đều vào mơi trường.
Để kiểm sốt chất lượng dịch vi khuẩn, chúng tôi đã cấy vi khuẩn lên các đĩa đối chứng chứa môi trường LB không bổ sung kháng sinh.
- Đọc kết quả
Đường kính vịng kháng khuẩn được đo bằng đơn vị mm theo cơng thức: D = (D1 + D2)/2 trong đó D là đường kính vịng.
Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.
Hình 2.4. Cách xác định vịng kháng khuẩn
2.2.4.2 Xác định MIC/MBC bằng phương pháp pha loãng (Broth dilution methods)
Mục đích của phương pháp pha lỗng là để xác định các giá trị MIC/MBC của một chất. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimal inhibitory concentration) là nồng độ thấp nhất mà tại đó chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 16 - 24 giờ nuôi cấy. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC - Minimal bactericidal concentration) là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn. MIC/MBC được xác định bằng cách đánh giá khả năng sống sót của một số lượng tế bào vi khuẩn đã xác định trong mơi lỏng có chứa các tác nhân kháng khuẩn đã biết trước nồng độ [10, 69].
- Vật liệu và hóa chất:
+ Mơi trường: CAMHB, MHA
+ Mẫu cao thực vật và dụng cụ thí nghiệm được chuẩn bị như trong phương pháp khuếch tán giếng thạch (mục 2.2.4.1).
+ Vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gram âm: E. coli ATCC 25922; S. typhimurium ATCC 14028;
Vi khuẩn Gram dương: S. aureus ATCC 25923; B. subtilis ATCC; B. cereus ATCC 10876.
- Quy trình thực hiện:
+ Chuẩn bị môi trường CAMHB: Môi trường MHB sau khi khử trùng được bổ sung 20-25 mg Ca2+ và 10-12.5 mg Mg2+ /1 lít mơi trường sau đó bảo quản ở 4-8oC.
+ Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn (chuẩn bị trong khoảng 15 phút trước khi sử dụng để đảm bảo đúng mật độ vi khuẩn cần dùng):
Các chủng vi khuẩn được ni cấy kích hoạt từ ống chủng gốc trên mơi trường MHA qua đêm ở điều kiện tối ưu, sau đó lựa chọn một khuẩn lạc đơn để chuyển sang nuôi cấy trong 5 ml môi trường CAMHB bằng máy lắc ủ nhiệt trong điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn.
Đo độ đục của dịch vi khuẩn bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm, điều chỉnh nồng độ vi khuẩn cho tới khi độ hấp thụ quang phổ đạt 0,08-0,1 tương đương với nồng độ vi khuẩn đạt 1-2 x 108 CFU/ml.
Pha lỗng dịch vi khuẩn 150 lần bằng mơi trường CAMHB để thu được dịch vi khuẩn có nồng độ 106 CFU/ml.
+ Chuẩn bị mẫu thử: Cao chiết được pha loãng từ dung dịch gốc thành dải nồng độ từ 50 – 2000 µg/ml với bước nhảy là 50 µg/ml.
+ Tiến hành thí nghiệm:
Chuyển 100 µl dung dịch cao chiết ở các nồng độ thử nghiệm vào các giếng trên đĩa 96.
Thêm 100 µl dịch vi khuẩn 106 CFU/ml vào các giếng trên và trộn đều.
Đối chứng âm chứa l00 µl mơi trường CAMHB và 100 µl dịch vi khuẩn.
Đối chứng vơ trùng là giếng chứa 200 µl mơi trường CAMHB.
Pha lỗng hỗn hợp chất thử và vi khuẩn ở các giếng 10, 100 lần và nuôi cấy trên môi trường MHA để kiểm tra nồng độ vi khuẩn trước khi ủ bằng cách đếm khuẩn lạc.
+ Đọc kết quả:
Sau 16 - 20 h ni cấy, tiến hành pha lỗng hỗn hợp trong các giếng 10, 100 lần và nuôi cấy trên môi trường MHA để đếm khuẩn lạc.
Các thí nghiệm pha lỗng và cấy đếm khuẩn lạc được thực hiện 3 lần, kết quả được lấy trung bình của 3 lần cấy đếm.
2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng nấm
Hoạt tính kháng nấm được xác định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Hadacek và cộng sự, 2000), trong đó chất thử nghiệm được bổ sung vào các giếng trên đĩa thạch đã được cấy bào tử nấm hoặc dịch nuôi cấy để đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật của chất thử nghiệm. Khi các chất đã khuếch tán đều vào môi trường nuôi cấy, các đĩa thử nghiệm được bọc kín và đem ni ở điều kiện tối ưu. Sau khoảng 3 - 5 ngày nuôi cấy (tùy thời gian sinh trưởng của vi sinh vật), các chất ức chế sự phát triển của vi nấm sẽ cho thấy sự xuất hiện của các vòng tròn kháng bao quanh giếng. Dựa vào kích thước vòng kháng mà người ta sẽ đánh giá được khả năng ức chế nấm của các chất thử nghiệm [10, 17].
- Vật liệu và hóa chất:
+ Mơi trường thử hoạt tính: Mơi trường PDA được chuẩn bị giống như môi trường LB (mục 2.2.4.1).
+ Vi sinh vật kiểm định: A. niger; C. albicans; P. digitatum.
+ Chuẩn bị mẫu: Mẫu cao chiết được chuẩn bị như trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch (mục 2.2.4.1).
- Dụng cụ: Đĩa 96 giếng, màng lọc Miracloth, máy ly tâm lạnh, kính hiển vi, buồng đếm Thoma và các dụng cụ khác như trong phương pháp khuếch tán giếng thạch (mục 2.2.4.1).
- Quy trình thực hiện:
+ Thu bào tử nấm (đối với các chủng sinh bào tử):
Các chủng nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường thạch khoai tây (PDA) trong khoảng 3 - 5 ngày ở 25 - 30oC để thu bào tử.
Bổ sung nước cất vô trùng lên bề mặt đĩa nuôi và dùng que gạt vô trùng tách bào tử ra khỏi hệ sợi nấm.
Loại bỏ hệ sợi nấm bằng màng Miracloth (Calbiochem, Đức). Phần dịch đi qua màng lọc sẽ được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu phần cặn. Phần cặn chứa bào tử nấm sẽ được rửa lại hai lần bằng nước cất vô trùng và ly tâm như trên để thu bào tử.
Dịch bào tử sau khi thu xong sẽ được xác định nồng độ bằng buồng đếm Thoma. Pha loãng dịch này đến nồng độ 106 bào tử/ml. Giữ dịch bào tử này ở 4-8oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
+ Chuẩn bị dịch nuôi cấy (đối với nấm men Candida albicans): tương tự như đối với chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn (xem mục 2.2.4.1).
+ Tiến hành cấy trải 100 µl dịch bào tử nấm (đạt nồng độ 106 CFU/ml) hoặc dịch nuôi cấy lên đĩa thạch PDA đã được chuẩn bị sẵn.
+ Sử dụng các ống có đường kính 6 mm tạo các giếng trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn. Bổ sung một thể tích mẫu phù hợp vào các giếng, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ 4-8oC trong vòng 2-4 giờ để mẫu có thể khuếch tán, đồng thời ngăn sự phát triển của nấm khi các chất chưa khuếch tán vào thạch.
+ Để kiểm soát chất lượng dịch bào tử nấm, cấy 100 µl dịch bào tử lên các đĩa thạch đối chứng chứa môi trường PDA không bổ sung kháng sinh.
+ Chuyển các đĩa thí nghiệm và đối chứng vào tủ ấm nuôi cấy trong điều kiện tối ưu của từng chủng nấm, kết quả được quan sát sau 3-5 ngày nuôi cấy. - Đọc kết quả: Đường kính vịng kháng nấm được xác định tương tự như đối với
vòng kháng khuẩn (xem mục 2.2.4.1)
2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa
Hoạt tính chống oxi hóa được xác định theo phương pháp của Patel và cộng sự (2011). Phương pháp được thực hiện dựa trên nguyên lý DPPH (1,1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch methanol 99%. Khi cho chất thử nghiệm vào dung dịch DPPH, nếu chất có khả năng quét các
của các gốc tự do DPPH. Ho thụ ánh sáng của dung d kết quả được đọc trên máy
Hình 2.5. Sơ đồ phả
- Vật liệu và hóa ch
và dung dịch axit ascorbic (10 mg/ml) đư trước khi sử dụng và b - Quy trình thực hi + Xây dựng đườ Chuẩn bị dung d 300, 400, 500, 600, 700 µg/ml trong methanol 99% Hút 50 µl dung d nghiệm đã đư Lần lượt bổ Tiếp tục bổ Vortex các m hấp thụ quang ph + Đối với mẫu th
nghiệm như trên.
+ Đo mẫu chuẩn (control) một ống nghiệ
do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thơng qua đ a dung dịch thử nghiệm so với dung dịch đối ch
ên máy đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517 nm
ản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất ch
u và hóa chất: Dung dịch DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)
ch axit ascorbic (10 mg/ml) được chuẩn bị trong methanol 99% ng và bảo quản tránh ánh sáng.
c hiện:
ờng chuẩn axit ascorbic
dung dịch axit ascorbic ở các nồng độ khác nhau: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 µg/ml trong methanol 99% từ
Hút 50 µl dung dịch axit ascorbic các nồng độ tương được bọc kín bằng giấy bạc để tránh ánh sáng. ổ sung thêm 2950 µl methanol vào các ống nghi
sung vào mỗi ống 1500 µl dung dịch DPPH 1 mM Vortex các mẫu và giữ trong tối ở nhiệt độ phòng, sau 15 phút
quang phổ ở bước sóng 517 nm.
u thử nghiệm, pha loãng tới nồng độ thích h m như trên.
n (control): Dùng pipet hút 3 ml dung dịch methano
ệm sạch được bọc giấy bạc. Bổ sung thêm 150 µl dung d c đánh giá thông qua độ hấp
i chứng là axit ascorbic, c sóng 517 nm [47]. t chống oxi hóa [40] picrylhydrazyl) 1 mM trong methanol 99% khác nhau: 100, 200, ừ dung dịch gốc. tương ứng vào các ống tránh ánh sáng. ng nghiệm trên. ch DPPH 1 mM
phịng, sau 15 phút đem đo độ
thích hợp rồi làm thí
ch methanol 99% vào sung thêm 150 µl dung dịch
DPPH 1 mM và lắc đều, ngay sau đó mang hỗn hợp đi đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517 nm. Ghi lại kết quả vừa đo được.
- Xử lý kết quả
+ Hoạt tính chống oxi hóa, đo bằng khả năng qt gốc tự do DPPH được tính theo cơng thức sau:
% Hoạt động = [(Acontrol - Amẫu thử nghiệm)/ Acontrol] × 100 Trong đó:
Acontrol: Độ hấp phụ bước sóng 517 nm của mẫu chuẩn.
Amẫu thực nghiệm: Độ hấp phụ tại bước sóng 517 nm của mẫu thử nghiệm. + Hoạt tính chống oxi hóa của mẫu thử nghiệm được tính tương đương với
hàm lượng chất chuẩn là axit ascorbic (µg/ml) dựa theo phương trình đường chuẩn y = 0,09060x - 1,40376.
Hình 2.6. Phương trình đường chuẩn axit ascorbic
2.2.7 Phương pháp thống kê
Kết quả thu được là giá trị trung bình của ít nhất 3 lần lặp lại thí nghiệm, được xử lý thống kê sinh học thông qua phần mềm Excel.
y = 0,09060x - 1,40376 R² = 0,98197 0 10 20 30 40 50 60 70 0 100 200 300 400 500 600 700 800 % H o ạ t đ ộ n g Nồng độ axit ascorbic (µg/ml)
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đánh giá hiệu suất và lựa chọn phương pháp tách chiết
Phenolic là một nhóm hợp chất thứ cấp được tìm thấy trong thực vật, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như là chất chống oxi hóa, kháng vi-rút, kháng khuẩn, chống ung thư, chống viêm, giảm đau, hạ sốt, … Nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng các hợp chất chính trong Tơ mộc chủ yếu là các phenol [12]. Đây cũng là nhóm hợp chất quyết định đến các hoạt tính sinh học của gỗ Tô mộc. Do đó, việc lựa chọn được phương pháp tách chiết phù hợp, đạt hiệu suất cao và không ảnh hưởng tới cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic trong gỗ Tô mộc cũng là