A – Sơ đồ tỷ lệ khối lượng cao chiết các phân đoạn gỗ Tô mộc B – Sơ đồ tỷ lệ hàm lượng Phenolic các phân đoạn gỗ Tơ mộc
3.3 Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết Tơ mộc
Sau khi thu được cao chiết các phân đoạn từ gỗ Tơ mộc, chúng tơi tiến hành sàng lọc để tìm ra phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất. Các cao chiết được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi khuẩn là E. coli và B. subtilis theo phương pháp khuếch tán giếng thạch của Hadacek và cộng sự (2000) (mục 2.2.4.1). 70 μl mỗi dung dịch cao chiết ở các nồng độ được bổ sung vào các giếng thạch trên đĩa petri cho mỗi thử nghiệm. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Gentamycin 20 µg/ml đối với chủng E. coli; rifampicin 1 µg/ml đối với chủng B. subtilis); đối chứng âm là dung dịch DMSO 10%. Kết quả thử hoạt tính kháng
Bảng 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn gỗ Tô mộc trên chủng E. coli VSV Phân đoạn ĐC (-) Nồng độ cao chiết (mg/ml) ĐC (+) 10 15 20 25 30 Gen 20 µg/ml E. coli nHF 0 0 0 0 0 0 11,2 ± 0,6 DMF 0 0 0 0 0 0 EAF 0 1,2 ± 0,2 2,3 ± 0,2 3,2 ± 0,6 5 ± 1,6 8 ± 0,8 EF 0 0 0,5 ± 0,2 2 ± 0,4 2,5 ± 0,4 3,3 ± 0,5
(Đường kính vịng kháng khuẩn được đo bằng đơn vị mm)
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của 4 phân đoạn gỗ Tơ mộc trên chủng E.
coli cho thấy phân đoạn ethyl acetate (EAF) có hoạt tính tốt nhất. Cao EAF có khả
năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. coli ở cả 5 nồng độ thử nghiệm. Phân
đoạn ethanol cho thấy khả năng ức chế E. coli yếu trong khi phân đoạn n-hexan và dichloromethane khơng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn (Bảng 3.3 và Hình 3.2).
Bảng 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn gỗ Tô mộc trên chủng B. subtilis
VSV Phân đoạn ĐC (-) Nồng độ cao chiết (mg/ml) ĐC (+) 1 2 3 4 5 Rif 1 µg/ml B. subtilis nHF 0 0 0 0 0 0 14 ± 0,2 DMF 0 0 0 0,5 ± 0,2 1,8 ± 0,2 3 ± 0,2 EAF 0 0,8 ± 0,2 4 ± 0,2 6,8 ± 0,2 9,2 ± 0,2 11 ± 0,2 EF 0 0 1,7 ± 0,2 4,3 ± 0,5 7 ± 0,2 8 ± 0,2
Khi thử nghiệm ho
B. subtilis, EAF tiếp t
đoạn ethanol. Phân đo trong khi phân đoạn n-
thử nghiệm (Bảng 3.4 và Hình 3.2 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khu (G20: Ge 10-30: N Kết quả thử nghi hoạt tính kháng khuẩn t mạnh (đường kính vịng kháng khu khả năng ức chế kém hơn trên ch độ cao chiết 30 mg/ml là 8 m
tính kháng khuẩn kém hơn trong khi n tơi quyết định lựa chọ
sinh học khác.
m hoạt tính kháng khuẩn của 4 phân đoạn gỗ p tục là phân đoạn cho thấy hoạt tính tốt nh n ethanol. Phân đoạn dichloromethane thể hiện khả năng ức ch
-hexan không cho thấy hoạt tính kháng khu 3.4 và Hình 3.2).
t tính kháng khuẩn các phân đoạn gỗ Tô mộ
E. coli và B. subtilis
(G20: Gentamycin 20 µg/ml; Rif 1: rifampicin 1 µg/ml
30: Nồng độ cao chiết (mg/ml); (-): Đối ch
nghiệm cho thấy phân đoạn ethyl acetate (EAF) là phân đo n tốt nhất trong số 4 phân đoạn với khả năng
ng kính vịng kháng khuẩn ở nồng độ cao chiết 5 mg/ml là 11 m kém hơn trên chủng E. coli (đường kính vịng kháng khu
t 30 mg/ml là 8 mm). Phân đoạn dichloromethane và ethanol có ho n kém hơn trong khi n-hexan không thể hiện ho
ọn EAF là phân đoạn để tiếp tục nghiên cứ
ỗ Tô mộc trên chủng t nhất sau đó là phân c chế B. subtilis kém t tính kháng khuẩn ở cả 5 nồng độ ộc trên 2 chủng cin 1 µg/ml; i chứng âm)
(EAF) là phân đoạn có năng ức chế B. subtilis t 5 mg/ml là 11 mm) và ng kính vịng kháng khuẩn ở nồng n dichloromethane và ethanol có hoạt n hoạt tính. Do đó chúng ứu tiếp các hoạt tính
3.4 Đánh giá hoạt kháng khuẩn của phân đoạn ethyl acetate (EAF)
3.4.1 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch thạch
Phân đoạn ethyl acetate của gỗ Tô mộc (EAF) tiếp tục được chúng tôi đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn S. aureus, B. cereus, P. aeruginosa và S. typhimurium bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả
được thể hiện trong bảng 3.5 và bảng 3.6:
Bảng 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn EAF trên chủng S. aureus và B. cereus VSV ĐC (-) Nồng độ cao chiết (mg/ml) ĐC (+) 1 2 3 4 5 S. aureus 0 2,7 ± 0,5 7 ± 0,2 9,2 ± 0,6 11,7 ± 0,5 12,3 ± 0,5 10,7 ± 0,5R0,1 B. cereus 0 2,3 ± 0,2 6,2 ± 0,2 7,7 ± 0,5 8,3 ± 0,5 9 ± 0,2 8 ± 0,2R20
(R0,1: Rifampicin 0,1 µg/ml; R20: Rifampicin 20 µg/ml; Đường kính vịng kháng khuẩn được đo bằng đơn vị mm)
Kết quả trình bày trên bảng 3.5 cho thấy cao EAF có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên cả 2 chủng Gram (+) là S. aureus và B. cereus. Ở nồng độ 4 mg/ml, cao EAF
có khả năng ức chế mạnh chủng S. aureus với đường kính vịng kháng khuẩn là
11,7 mm, lớn hơn hoạt tính của kháng sinh rifampicin nồng độ 0,1 µg/ml (10,7 mm). Cũng ở nồng độ 4 mg/ml, EAF cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tương đương với kháng sinh rifampicin nồng độ 20 µg/ ml trên chủng B. cereus (Hình
Hình 3.3. H (R0,1: Rifampicin 0,1 µg/ml; R20: Rifampi 1-5: N Bảng 3.6. H chủng S. typhimurium VSV ĐC (-) S. typhimurium 0 2,5 P. aeruginosa 0 3,5
(G20: Gentamycin 20 µg/ml; G50: Gentamycin 50 µg/ml; Đư
. Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF trên ch
S. aureus và B. cereus
R0,1: Rifampicin 0,1 µg/ml; R20: Rifampicin 20 µg/ml; 5: Nồng độ cao chiết (mg/ml); (-): Đối chứng âm)
Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn EAF
ng S. typhimurium và P. aeruginos Nồng độ cao chiết (mg/ml) 10 20 30 40 2,5 ± 0,2 6,8 ± 0,3 8,5 ± 0,5 9,8 ± 0,3 3,5 ± 0,5 7,5 ± 1,5 10,3 ± 0,3 12 ± 0,2 13
(G20: Gentamycin 20 µg/ml; G50: Gentamycin 50 µg/ml; Đườ khuẩn được đo bằng đơn vị mm)
n EAF trên chủng cin 20 µg/ml; ng âm) n EAF trên ĐC (+) 50 11,5 ± 0,5 7,8 ± 0,8G20 13 ± 0,2 8 ± 0,2G50 ờng kính vịng kháng
Đối với 2 chủng Gram (-) là S. typhimurium và P. aeruginosa cao EAF thể
hiện hoạt tính kháng khuẩn kém hơn so với các chủng Gram (+). Ở nồng độ 30 mg/ml cao EAF cho thấy khả năng ức chế (với đường kính vịng kháng khuẩn lần lượt là 8,5 và 10,3 mm) tốt hơn kháng sinh gentamycin nồng độ 20 µg/ml (4,8 mm) và 50 µg/ml (8 mm) trên cả 2 chủng vi khuẩn (Hình 3.4).
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF trên chủng S.
typhimurium và P. aeruginosa
(G20: Gentamycin 20 µg/ml; G50: Gentamycin 50 µg/ml;
10-50: Nồng độ cao chiết (mg/ml); (-): Đối chứng âm)
3.4.2 Kết quả xác định MIC/MBC bằng phương pháp pha loãng
Các kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có ý nghĩa sàng lọc và đánh giá sơ bộ để tìm ra các chất có hoạt tính. Vì vậy, để đưa ra các kết luận chính xác hơn về khả năng ức chế các chủng vi sinh vật của cao dược liệu, chúng tôi đã tiến hành xác định các giá trị MIC/MBC. Giá trị MIC/MBC được xác định bằng phương pháp pha loãng (Broth dilution methods) theo tiêu chuẩn CLSI 2015 (mục 2.2.4.2), các kết quả được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả xác định MIC/MBC của cao EAF trên các chủng VSV Chủng VSV MIC (µg/ml) MBC (µg/ml) Chủng VSV MIC (µg/ml) MBC (µg/ml) E. coli Gram (-) < 1250 < 1500 P. aeruginosa < 1800 < 1900 S. typhimurium < 800 < 850 S. aureus Gram (+) < 150 < 200 B. cereus < 175 < 200 B. subtilis < 550 < 600
Kết quả trình bày trên bảng 3.7 đã cho thấy cao EAF có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Gram (+) tốt hơn so với các chủng Gram (-). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao EAF trên 2 chủng S. aureus và B. cereus lần lượt là 150 µg/ml và 175 µg/ml. Ở nồng độ 200 µg/ml cao EAF cho thấy khả năng diệt khuẩn đối với cả 2 chủng này. Các kết quả này gần với các giá trị MIC/MBC của cao chiết ethanol gỗ Tô mộc trên chủng S. aureus ATCC 25923 trong một nghiên cứu của Nirmal và cộng sự (2014) là 250 µg/ml [43]. Đối với chủng B. subtilis, giá trị MIC/MBC được xác định lần lượt là 550 và 600 µg/ml, cho thấy hoạt tính kháng khuẩn khá tốt của cao EAF.
Với các chủng Gram (-) cao EAF thể hiện hoạt tính kháng khuẩn kém hơn với giá trị MIC/MBC được xác định lớn hơn rất nhiều lần so với các chủng Gram (+). Trong đó EAF có khả năng ức chế S. typhimurium (MIC <800 µg/ml) tốt hơn 2
chủng E. coli và P. aeruginosa (MIC lần lượt là 1250 và 1800 µg/ml). Nồng độ diệt khuẩn của cao EAF trên 2 chủng E. coli và P. aeruginosa đều ở mức cao, lần lượt là 1500 và 1900 µg/ml. Trong nghiên cứu của Nilmak và cộng sự (2014), giá trị
MIC/MBC của cao chiết ethanol gỗ Tô mộc trên chủng E. coli ATCC 25922 cũng được xác định ở mức cao là 1000 µg/ml [43].
Từ các kết quả trên, có thể nhận thấy cao EAF chiết xuất từ gỗ Tơ mộc có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên các chủng Gram (+) so với các chủng Gram (-). Kết quả này tương đồng với các kết quả nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Tơ mộc đã được cơng bố trước đó [31, 68].
3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn ethyl acetate trên các chủng Vibrio chủng Vibrio
Vibrio được biết đến như một mầm bệnh vi khuẩn trên tôm từ những năm
1990, là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng sơ cấp và thứ cấp. Với nhiễm trùng sơ cấp, Vibrio đã trở thành một mối quan tâm lớn hơn sau khi Tran và cộng sự (2013) báo cáo Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND). Vibrio lây truyền qua đường miệng, sau đó chúng xâm nhập vào đường tiêu hóa của tơm, tạo ra độc tố gây phá hủy mô, làm rối loạn chức năng của gan tụy và các cơ quan tiêu hóa của tơm.
Do đặc tính sinh học có khả năng kháng lại các loại kháng sinh cộng thêm khả năng bùng phát và lây lan nhanh chóng nên khi ao ni bị nhiễm Vibrio, vấn đề
kiểm sốt, tiêu diệt lồi vi khuẩn này gặp rất nhiều khó khăn. Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng sinh để kiểm soát Vibrio cũng bị hạn chế và quản lý chặt chẽ bởi khi dư lượng thuốc kháng sinh trong tôm vượt quá mức cho phép sẽ gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng tới chất lượng tơm xuất khẩu. Ngồi ra, thuốc kháng sinh khơng dùng để phòng bệnh, sử dụng kháng sinh khơng đúng cách khi khơng có sự giám sát của bác sỹ thú y có thể dẫn đến các vấn đề liên quan đến kháng thuốc kháng sinh. Vì vậy hiện nay việc sử dụng các hợp chất tự nhiên từ thực vật để kiểm soát các bệnh nhiễm khuẩn trong tôm đang được quan tâm chú ý.
3.4.3.1 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao EAF trên các chủng Vibrio
Chúng tơi đã tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn của cao EAF trên 4 chủng
V. parahaemolyticus (VP1, VP2, VP3, VP4) và V. harveyi (VH) bằng phương pháp
khuếch tán trên thạch (mục 2.2.4.1), kết quả được thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của cao EAF trên các chủng Vibrio
VSV ĐC (-) Nồng độ cao chiết (mg/ml) ĐC (+) 1 2 3 4 5 VP1 0 1,0 ± 0 4,4 ± 0,5 6,2 ± 0,5 7,9 ± 0,7 9,1 ± 0,7 5,6 ± 0,5C10 VP2 0 0 9 ± 0,2 11,2 ± 0,2 12,3 ± 0,2 13,7 ± 0,5 8,3 ± 0,2C10 VP3 0 0 3,7 ± 0,5 6,3 ± 0,5 8 ± 0,8 9,3 ± 1,2 8,3 ± 0,5C10 VP4 0 10,5 ± 0,5 13 ± 1 14,8 ± 0,3 15,8 ± 0,3 17,3 ± 0,3 4 ± 0,2C1000 VH 0 12 ± 2 13 ± 2 16 ± 2,5 18 ± 3 18,5 ± 2,5 8 ± 1C10
(C10: Chloramphenicol 10 µg/ml; C1000: Chloramphenicol 1 mg/ml; đường kính vịng kháng khuẩn được đo bằng đơn vị mm)
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn cho thấy, cao EAF có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên cả 5 chủng Vibrio. EAF thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương đương trên 2 chủng VP1 và VP3 với đường kính vịng kháng khuẩn ở cùng một nồng độ
cao là tương đối giống nhau. EAF cũng cho thấy khả năng ức chế mạnh chủng VP2, ở nồng độ cao 2mg/ml, phân đoạn này có hoạt tính mạnh hơn kháng sinh chloramphenicol nồng độ 10 µg/ml. Đặc biệt, EAF thể hiện khả năng ức chế mạnh 2 chủng VP4 và VH. Đây là 2 chủng được đánh giá là mạnh nhất và khó kiểm sốt nhất khi gây bệnh trên tôm. Ở nồng độ cao 1 mg/ml, cao EAF đã cho thấy hoạt tính mạnh hơn rất nhiều so với dung dịch kháng sinh đối chứng là chloramphenicol nồng độ 10 µg/ml và 1 mg/ml (Bảng 3.8 và Hình 3.5).
Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EAF trên các chủng Vibrio
(C10: C10: Chloramphenicol 10 µg/ml; C1000: Chloramphenicol 1 mg/ml; 1-5: Nồng độ cao chiết (mg/ml); (-): Đối chứng âm)
Từ các kết quả khả quan thu được, chúng tơi có thể đưa ra kết luận rằng cao EAF có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên cả 5 chủng Vibrio và có tiềm năng rất lớn trong việc phát triển các chế phẩm sinh học ứng dụng phòng và điều trị các bệnh dịch trên tôm do vi khuẩn Vibrio gây ra.
3.4.3.2 Kết quả đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của cao EAF trên các chủng Vibrio trong môi trường lỏng
Phân đoạn ethyl acetate chiết xuất từ gỗ Tô mộc đã cho thấy khả năng ức chế mạnh vi khuẩn Vibrio thông qua các kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn bằng
phương pháp khuếch tán trên thạch. Do đó chúng tơi đã tiếp tục tiến hành một thí nghiệm để đánh giá mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Vibrio với cao chiết EAF trong
được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Vibrio ở các nồng độ 100, 200, 300, 400 và 500 µg/ml, sau đó đem ni lắc ở điều kiện tối ưu 30oC (200 vòng/ phút). Dịch vi khuẩn được lấy mẫu định kỳ sau mỗi 1giờ nuôi cấy để đánh giá sự phát triển của vi khuẩn bằng cách đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 600 nm. Kết quả khảo sát sự phát triển của vi khuẩn Vibrio khi có mặt cao EAF trong 7 giờ liên tục được hiển thị trên các sơ đồ hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio của cao EAF
Kết quả đánh giá mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Vibrio với cao chiết EAF
được nuôi cấy trong môi trường tối ưu, khơng có mặt chất ức chế, tương đương nồng độ cao chiết 0 µg/ml). Kết quả thử nghiệm trên chủng VP1 cho thấy cao EAF ở nồng độ 400 và 500 µg/ml đã ức chế sự phát triển của vi khuẩn chỉ sau 3 giờ nuôi cấy trong khi mẫu đối chứng âm vi khuẩn phát triển bình thường, các nồng độ khác khơng cho thấy sự ức chế (Hình 3.6A). Đối với chủng VP2, cao chiết EAF cũng cho thấy sự ức chế tăng trưởng rõ rệt ở nồng độ cao chiết 400 và 500 µg/ml sau 4 giờ nuôi cấy, trong 3 giờ tiếp theo cũng không nhận thấy sự phát triển của vi khuẩn ở 2 nồng độ thử nghiệm này (Hình 3.6B).
Cao chiết EAF tiếp tục cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của chủng VP3 ở nồng độ cao 400 và 500 µg/ml chỉ sau 2 giờ quan sát. Trong 5 giờ tiếp theo, ở 2 nồng độ này chúng tôi cũng không quan sát thấy sự phát triển rõ ràng của vi khuẩn
VP3 trong khi ở mẫu đối chứng âm và mẫu có nồng độ cao chiết 100 µg/ml vi
khuẩn vẫn phát triển bình thường. Nồng độ 200 và 300 µg/ml cao chiết cho thấy sự ức chế nhẹ, vi khuẩn phát triển chậm hơn so với mẫu đối chứng âm (Hình 3.6C). Đối với chủng VP4, cao EAF cho thấy hoạt tính ức chế tăng trưởng rõ rệt ở nồng độ từ 200 µg/ml sau 3 giờ ni cấy. Nồng độ 100 µg/ml chưa cho thấy sự ức chế rõ ràng trong 7 giờ quan sát, mẫu đối chứng âm vi khuẩn phát triển bình thường (Hình 3.6D).