2.2.7 Phương pháp thống kê
Kết quả thu được là giá trị trung bình của ít nhất 3 lần lặp lại thí nghiệm, được xử lý thống kê sinh học thông qua phần mềm Excel.
y = 0,09060x - 1,40376 R² = 0,98197 0 10 20 30 40 50 60 70 0 100 200 300 400 500 600 700 800 % H o ạ t đ ộ n g Nồng độ axit ascorbic (µg/ml)
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đánh giá hiệu suất và lựa chọn phương pháp tách chiết
Phenolic là một nhóm hợp chất thứ cấp được tìm thấy trong thực vật, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như là chất chống oxi hóa, kháng vi-rút, kháng khuẩn, chống ung thư, chống viêm, giảm đau, hạ sốt, … Nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng các hợp chất chính trong Tơ mộc chủ yếu là các phenol [12]. Đây cũng là nhóm hợp chất quyết định đến các hoạt tính sinh học của gỗ Tô mộc. Do đó, việc lựa chọn được phương pháp tách chiết phù hợp, đạt hiệu suất cao và không ảnh hưởng tới cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic trong gỗ Tô mộc cũng là một vấn đề quan trọng. Có nhiều phương pháp chiết xuất đã được báo cáo để thu nhận các hợp chất phenolic nhưng phương pháp chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm được đánh giá là phương pháp phù hợp nhất [9, 16, 52].
Vì vậy, dựa theo điều kiện sẵn có tại phịng thí nghiệm, chúng tơi đã lựa chọn phương pháp tách chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm là phương pháp thu nhận các hoạt chất từ gỗ Tơ mộc. Ngồi sự hỗ trợ của sóng siêu âm, chúng tơi cịn sử dụng phương pháp khuấy trộn tạo dịng chảy hướng tâm để giúp q trình chiết rút dược chất ra khỏi dược liệu được tốt hơn [11]. Các thử nghiệm đã được thực hiện để so sánh hiệu suất tách chiết khi có sự hỗ trợ của sóng siêu âm và khuấy trộn so với phương pháp chiết xuất thông thường. Hiệu suất tách chiết được đánh giá thông qua khối lượng cao và hàm lượng Phenolic tổng số trong cao chiết thu được.
10 g bột gỗ Tô mộc được ngâm chiết trong 100 ml ethanol 95% (tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/10, w/v) ở ba điều kiện:
- ĐK 1: Chiết ngâm thông thường
- ĐK 2: Chiết ngâm với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (15 phút)
- ĐK 3: Chiết ngâm với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (15 phút) và khuấy trộn tạo hiệu ứng dòng chảy hướng tâm (200 vòng/ phút) [44]
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ phòng (25oC), tiến hành chiết rút 3 lần (mỗi lần 4 giờ). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc tinh, dịch lọc 3 lần được tập hợp và loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ <40oC thu cao chiết tổng số. Chiết xuất thu được trong 3 điều kiện tách chiết trên sẽ được tiến hành xác định hàm lượng Phenolic tổng số theo TCVN 9745-1:2013 bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteau. Phương trình đường chuẩn axit gallic y = 0,011x + 0,015 là cơ sở để xác định hàm lượng Phenolic trong các mẫu thử (mục 2.2.3). Kết quả chiết xuất gỗ Tô mộc trong 3 điều kiện nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.1 (Kết quả lấy giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm).
Bảng 3.1. Hiệu suất tách chiết gỗ Tô mộc
ĐK
Khối lượng (g) Hiệu suất tách chiết
(%)
Hàm lượng Phenolic (g GAE)
Nguyên liệu Cao chiết 1 g cao chiết 10 g bột TM
ĐK 1
10
0,746 7,46 0,970 0,724
ĐK 2 1,059 10,59 0,780 0,826
ĐK 3 1,180 11,8 0,997 1,177
Kết quả trình bày trong bảng 3.1 cho thấy, khi bột gỗ Tô mộc được chiết xuất theo phương pháp ngâm chiết thông thường (ĐK 1), khối lượng cao chiết thu được là 0,746 g (tương ứng với hiệu suất tách chiết là 7,46%). Trong nhiều nghiên cứu đã công bố trước đó, hiệu suất tách chiết gỗ Tô mộc bằng phương pháp ngâm chiết tương tự trong dung môi ethanol 95% cũng được báo cáo luôn nhỏ hơn 10% [28, 58, 66]. Ở các điều kiện tách chiết khác (ĐK 2 và ĐK 3), khối lượng cao chiết thu được và hàm lượng Phenolic tổng số trong cao chiết lớn hơn hẳn so với ĐK 1. Trong đó ĐK 3 cho hiệu suất cao nhất với khối lượng cao thu được là 1,18 g (tương ứng với hiệu suất là 11,8%) và hàm lượng Phenolic là 1,177 g.
Với những kết quả thu được có thể nhận thấy sự hỗ trợ của sóng siêu âm và phương pháp khuấy trộn tạo hiệu ứng dòng chảy hướng tâm đã giúp nâng cao hiệu suất tách chiết, làm tăng chất lượng cao chiết (được thể hiện thông qua hàm lượng Phenolic tổng số trong cao) và rút ngắn thời gian tách chiết. Do đó chúng tôi lựa chọn ĐK 3 sẽ là phương pháp được sử dụng để tách chiết gỗ Tô mộc thu nhận cao chiết dược liệu sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2 Kết quả tách chiết thu phân đoạn
Khi nghiên cứu sàng lọc sơ bộ để tìm ra các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ thực vật, các nhà khoa học thường phân lập chiết xuất thực vật thành các nhóm hợp chất dựa vào khả năng hòa tan trong các dung mơi có độ phân cực khác nhau. Có hai hình thức thường được áp dụng, thứ nhất là chiết phân đoạn trực tiếp bằng phương pháp chiết lỏng - rắn sử dụng các dung mơi có độ phân cực tăng dần. Phương pháp thứ hai là tách chiết thu cao tổng số bằng các dung mơi có độ phân cực mạnh như ancol và hỗn hợp của chúng với nước để thu cao chiết thô. Sau đó tiến hành chiết phân đoạn bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng sử dụng hệ số phân tách của các dung mơi khơng hịa trộn vào nhau. Phương pháp này thường được áp dụng cho các quy mô nghiên cứu lớn khi lượng mẫu nhiều, cao chiết thu được có thể bảo quản trong thời gian dài và tiến hành phân đoạn khi cần thiết [55]. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp chiết phân đoạn trực tiếp từ dược liệu. Đây là phương pháp thường được sử dụng ở quy mô nghiên cứu nhỏ, áp dụng đối với lượng mẫu ít do mất nhiều thời gian thực hiện với nhiều công đoạn tách chiết.
10 g bột gỗ Tô mộc được chiết lần lượt với bốn loại dung mơi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan, dichloromethane, ethyl acetate và ethanol với sự hỗ trợ của sóng siêu âm và khuấy trộn tạo dịng chảy hướng tâm. Mẫu bột gỗ Tơ mộc đươc chiết lặp lại 3 lần với cùng loại dung môi (mỗi lần 4 h), dịch chiết được lọc qua giấy lọc tinh sau đó tập hợp lại và cơ quay loại bỏ dung môi thu cao chiết khô. Phần bã dược liệu sẽ được sấy khô loại dung môi để tiến hành tách chiết tiếp với dung mơi
khác. Tất cả q trình tách chiết được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ < 40oC để đảm bảo các hoạt chất trong cao chiết không bị ảnh hưởng. Kết quả khối lượng cao khô các phân đoạn thu được thể hiện trong bảng 3.2 (Kết quả lấy giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm).
Bảng 3.2. Kết quả chiết phân đoạn gỗ Tô mộc
Phân đoạn Khối lượng
cao (g) Đặc điểm cao chiết
Hàm lượng Phenolic (mg GAE /1 g cao chiết)
n-hexan
(nHF) 0,018
Màu vàng tươi, dạng ướt,
nhiều dầu 1,36 Dichloromet hane (DMF) 0,045 Màu nâu nhạt, dạng bột khô 127,27 Ethyl acetate (EAF) 0,723
Màu nâu đỏ, có màu đỏ hồng khi hịa trong nước, có màu vàng tươi khi hịa tan trong EtOH/MeOH
589,09
EtOH (EF) 0,405 Màu nâu nhạt, dạng bột
khô 413,64
Tổng 1,190 1,131(g)
Kết quả thí nghiệm cho thấy khi chiết phân đoạn lần lượt với 4 dung mơi có độ phân cực tăng dần, chúng tôi thu được tổng lượng cao chiết là 1,19 g (từ 10 g bột gỗ Tô mộc ban đầu). Tổng khối lượng cao thu được gần tương đương với khối lượng cao tổng số ethanol thu được ở thí nghiệm trước đó (1,18 g). Sự sai lệch không đáng kể (<1%) có thể là do các cao phân đoạn cịn tồn tại ở dạng dầu (phân đoạn n-hexan). Phân đoạn ethyl acetate thu được khối lượng cao nhiều nhất (60,72%) và cũng là phân đoạn có hàm lượng Phenolic lớn nhất (52,07%) trong số 4 phân đoạn, sau đó là phân đoạn ethanol với khối lượng cao thu được là 0,405 g
(34,03%) và hàm lượng Phenolic là 413,64 mg GAE/ 1g cao chiết, chiếm 36,56% hàm lượng Phenolic tổng số của 4 phân đoạn. Phân đoạn dichloromethane thu được khối lượng cao ít hơn 0,045 g (3,78%) với hàm lượng Phenolic là 127,27 mg GAE/1g cao chiết (chiếm 11,25%) trong khi phân đoạn n-hexan thu được khối lượng cao không đáng kể (chỉ chiếm 1,47% khối lượng cao tổng số) và hầu như khơng chứa Phenolic (Hình 3.1).