Kết quả giải trình tự gen SNP rs9934438 trên gen VKORC1 được thể hiện qua ảnh giải trình tự: sản phẩm giải trình tự r n t. Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và khơng có tín hiệu nhiễu. Kết quả giải trình tự gen xác định được ba kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG, kiểu gen dị hợp tử: AG và kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA.
So sánh kết quả xác định kiểu gen của hai SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở 20 mẫu nghiên cứu đầu tiên sử dụng phương pháp giải trình tự gen và phương pháp RFLP chúng tôi nhận thấy kiểu gen của cả 20 mẫu này đều tương đồng hoàn toàn khi thực hiện xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP và phương pháp giải trình tự gen. Mặc dù phương pháp giải trình tự gen được coi là tiểu chuẩn vàng trong việc phát hiện các đa hình thái đơn gen (SNP). Tuy nhiên, thực hiện phương pháp này địi hỏi chi phí cao và tốn nhiều thời gian. Do đó, chúng tôi s sử dụng phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 với các mẫu tiếp theo trong nghiên cứu để giảm chi
phí, tiết kiệm thời gian cho bệnh nhân và giảm thời gian cho nghiên cứu.
3.3. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP
rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
3.3.1. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3
Sau khi phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 bằng phương pháp PCR-GTT. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen như sau:
Bảng 3.6. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3
SNP Số lƣợng kiểu gen trên
từng alen (%) Tần số phân bố alen
rs1057910 (n=100)
CC AC AA A C
p-value (Chi-square test) 0 4% 96% 0,98 0,02 0,84
Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 (với n=100) cho kết quả: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA chiếm tỉ lệ 96% và chỉ có 4% bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AC. Trong nghiên cứu này của chúng tôi cũng chưa xuất hiện kiểu gen đồng hợp tử đột biến CC.
Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3: alen C (0,02) chiếm tỉ lệ rất thấp so với alen A (0,98).
3.3.2. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Sau khi tiến hành phân tích kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR-RFLP cho các mẫu bệnh nhân còn lại
trong nghiên cứu. Chúng tôi thu được kết quả: tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1.
Bảng 3.7. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1
SNP
Số lƣợng kiểu gen trên
từng alen (%) Tần số phân bố alen
GG AG AA G A
p-value (chi-square) rs9923231(n=100) 1% 32% 67% 0,17 0,83 0,18 rs9934438(n=100) 3% 11% 86% 0,075 0,925 0,0034
Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1: tỷ lệ bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA và dị hợp tử AG lần lượt là 67% và 32%. Trong khi đó bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG chỉ chiếm tỉ lệ 1% trong nghiên cứu này.
Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1: tỉ lệ nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA trong nghiên cứu của chúng tơi
chiếm đến 86%, cịn lại 11% bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AG và tỉ lệ bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG chỉ chiếm 3% trong nghiên cứu của chúng tôi.
Tần số phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1: alen A chiếm tỉ lệ cao (0,83) so với alen G (0,17).
Tần số phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1: alen A chiếm tỉ lệ cao (0,925) so với alen G (0,075).
3.4. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Kết quả kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1: người mang kiểu gen AA+AA chiếm tỷ lệ cao nhất là 67%. Các kiểu gen
GG+AA, AG+GG chỉ chiếm số lượng rất ít với tỷ lệ lần lượt là 1% và 2%.
AA+AA 67% GG+AA 1% AG+AA 19% AG+AG 11% AG+GG 2%
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
Acenocoumarol là thuốc chống đông máu đường uống thuộc nhóm AVK được sử dụng khá phổ biến trong: phòng ngừa, điều trị huyết khối động mạch và tĩnh mạch ở bệnh nhân sau thay van tim cơ học [3]. Tuy nhiên, thuốc có giới hạn điều trị rất hẹp nên gây ra nhiều biến chứng khi không sử dụng đúng liểu lượng: nếu bệnh nhân sử dụng liều acenocoumarol quá liều s gây biến chứng xuất huyết, nghiêm trọng nhất là xuất huyết não, nếu bệnh nhân sử dụng liều thuốc ở dưới liều cần dùng thì lại gây biến chứng huyết khối như tắc mạch và kẹt van, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở bệnh nhân sau thay van tim [3]. Yếu tố di truyền và mơi trường được dự tính đóng vai trị quyết định liều thuốc tối ưu cho mỗi cá nhân. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh ảnh hưởng của đa hình di truyền gen CYP2C9 và gen VKORC1 có ảnh hưởng đến việc tiên lượng và quyết định liều lượng sử dụng thuốc chống đông máu acenocoumarol cho từng bệnh nhân [25][113].
Gen VKORC1 mã hóa cho enzym Vitamin K epoxide reductase 1 là enzym đích tác dụng của thuốc acenocoumarol, enzym này chịu trách nhiệm chuyển hóa vitamin K dạng oxy hóa thành vitamin K dạng khử. Sự hiện diện của các biến thể của gen VKORC1 gây nguy cơ cao quá liều thuốc, trong trường hợp này nên sử
dụng liều thuốc thấp hơn để có thể đạt được khoảng INR trong giới hạn đích điều trị (2,0 - 3,5) [20]. Do vậy, việc xác định các alen đột biến của gen này rất hữu ích cho việc lựa chọn liều thuốc phù hợp với từng cá thể người bệnh mang lại hiệu quả điều trị đồng thời hạn chế các biến chứng nguy hiểm cho bệnh nhân.
Alen đa hình của gen CYP2C9 được chứng minh có liên quan tới việc gia tăng gấp đôi nguy cơ chảy máu so với alen kiểu dại. Mặc dù có ít cơng bố về mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 với liều thuốc acenocoumarol, một
số các nghiên cứu cũng chỉ ra mối liên quan giữa kiểu gen CYP2C9*3 và nguy cơ chảy máu gây ra bởi acenocoumarol. Sự hiện diện của một alen CYP2C9*3 làm
giảm sự chuyển hóa bình thường của dạng S-acenocoumarol, dạng có tác dụng lâm sàng và do đó làm tăng thời gian bán hủy của enantiomer này [49][67]. Có nghĩa là liều acenocoumarol cần thiết ở người mang alen *3 thấp hơn ở người mang alen kiểu dại khoảng 19 - 35% [35][62] và thấp hơn người mang alen *2 khoảng 13 - 15% [66].
Tại Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về mặt di truyền học liên quan tới việc chỉ định liều dùng thuốc acenocoumarol sử dụng cho bệnh nhân sau thay van tim được thực hiện. Do đó, chúng tơi muốn xây dựng quy trình phân tích đa hình gen CYP2C9 và VKORC1 trên mẫu máu bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông acenocoumarol nhằm xác định và đánh giá tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, rs9934438 trên gen VKORC1.
4.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu: tuổi trung bình của bệnh nhân là 51,14 tuổi, độ tuổi phân bố rộng từ 31 tuổi đến 66 tuổi. Lứa tuổi nhỏ hơn 15 tuổi khơng ghi nhận, có thể do nhóm này được khám và điều trị chuyên khoa nhi. Tỷ lệ bệnh nhân nữ chiếm ưu thế (nữ/nam: 1,43%). Chỉ số IBM của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều ở mức bình thường (IBM = 21,67 2,85). Tỷ lệ bệnh nhân mắc tăng huyết áp chỉ chiếm 14% trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu. Và 100% bệnh nhân đều có INR nằm trong khoảng INR mục tiêu (INR<3).
Lý do nhập viện và các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân phong phú, đa dạng, các triệu chứng được ghi nhận như sau: tăng áp động mạch phổi, khó thở khi gắng sức, đau tức ngực, rối loạn nhịp tim, uể oải do cung lượng tim giảm thấp, ngất. Trong đó triệu chứng bệnh nhân bị tăng áp động mạch phổi chiếm 22%. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến phải phẫu thuật thay van tim như: bệnh lý viêm nội tâm mạc, bệnh lý thoái hoá van, bệnh lý thấp tim và những nguyên nhân khác. Tuy nhiên trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu của chúng tơi có đến 72% bệnh nhân thay van tim nguyên nhân là do tiền sử bệnh lý thấp tim và chỉ có 6% bệnh nhân thay van tim do nguyên nhân bệnh lý viêm nội mạc tâm thất.
4.2. Phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 gen VKORC1
Ngày nay, kinh tế và đời sống của con người ngày càng phát triển và nâng cao đi đơi với nó là lĩnh vực sức khỏe cũng được quan tâm nhiều hơn. Những kĩ thuật giúp phát hiện sớm bệnh và sử dụng những phương pháp điều trị tiên tiến nhằm giảm chi phí và điều trị trúng đích ngày càng được chú trọng hơn. Y sinh học phân tử ra đời nhằm hỗ trợ việc xác định chính xác căn ngun bệnh và từ đó đưa ra liệu pháp điều trị đích phù hợp. Với kỹ thuật này, ngày nay chúng ta có thể phân tích một đoạn gen bất kì nào đó để phát hiện những bất thường, các dấu hiệu, nguy cơ bệnh tật từ đó có thể đưa ra chẩn đốn sớm và có cách điều trị phù hợp.
Để xác định các kiểu gen của từng alen, bệnh nhân cần trải qua quá trình tiến hành xét nghiệm bằng cách lấy mẫu máu bệnh nhân, bảo quản trong ống có chứa chất chống đơng EDTA. Mẫu được bảo quản theo tiêu chuẩn và chuyển đến phòng xét nghiệm để tiến hành quy trình xác định kiểu gen. Đầu tiên, mẫu sinh phẩm của bệnh nhân s được tách DNA tổng số, đây là khâu đầu tiên và rất quan trọng vì chất lượng sản phẩm DNA có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của các kĩ thuật y sinh học phân tử tiếp theo. Sản phẩm DNA sau khi được tách chiết phải có nồng độ đảm bảo, độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy, không nhiễm tạp. Để kiểm tra chất lượng sản phẩm DNA tổng số, chúng tôi sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang để đánh giá định lượng. Bước tiếp theo của nghiên cứu là khuếch đại đoạn gen chứa SNP
CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.
Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả như: kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP), giải trình tự gen, kỹ thuật sử dụng đầu dị DNA (DNA-probe). Tuy nhiên, trong số đó, PCR-RFLP và giải trình tự gen là hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Quy trình PCR đã được tối ưu tốt và sản phẩm thu là: đoạn gen dài 719 bp chứa SNP CYP2C9*3, đoạn gen dài 771 bp chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và đoạn gen dài 714 bp chứa SNP
rs9934438 trên gen VKORC1. Sử dụng sản phẩm PCR thu được, chúng tôi tiếp tục
tinh sạch và xác định nồng độ DNA trước khi thực hiện gửi giải trình tự và RFLP. Trong các mẫu nghiên cứu của chúng tôi khi tiến hành xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp giải trình
tự gen đều cho kết quả ba loại kiểu gen: đồng hợp tử đột biến: GG, dị hợp tử: AG và đồng hợp tử kiểu dại: AA. Trong khi đó, khi xác định kiểu gen của SNP
CYP2C9*3 bằng phương pháp giải trình tự gen thì chỉ cho kết quả hai kiểu gen:
đồng hợp tử kiểu dại: AA và dị hợp tử: AC (không thấy xuất hiện bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến: CC).
Mặc dù phương pháp giải trình tự gen vẫn là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự gen địi hỏi chi phí cao, thời gian thực hiện lâu. Vì vậy, ngồi phương pháp giải trình tự gen, chúng tơi xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp
RFLP vì cả hai SNP này đều có vị trí cắt đặc hiệu với enzyme cắt tương ứng là Msp1 và HinfI. Cịn SNP CYP2C9*3 khơng có vị trí cắt đặc hiệu nên chúng tơi chỉ sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định kiểu gen của SNP này.
Sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9923231 trên gen VKORC1 cho kết
quả kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (AA), kiểu gen đồng hợp tử đột biến (GG), kiểu gen dị hợp tử (AG).
Sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9934438 trên gen VKORC1 cho kết
quả kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến (GG), kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (AA) và kiểu gen dị hợp tử (AG).
Thực hiện so sánh và đối chiếu kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự gen và kỹ thuật RFLP trên 20 bệnh nhân đầu với SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1 chúng tôi nhận thấy cả hai kĩ thuật xác định kiểu gen này đều cho kết quả như nhau. Trong đó, kỹ thuật RFLP thao tác đơn giản, chi phí rẻ và thời gian xác định được kiểu gen nhanh hơn. Do đó, tất cả các mẫu bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu cịn lại chúng tôi đều sử dụng phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1.
Kết quả phân tích gen của chúng tơi có sự tương đồng với các nghiên cứu trước đó. Với gen CYP2C9 nghiên cứu của nhiều tác giả sử dụng phương pháp giải trình tự sử dụng cặp mồi nhân dịng khác nhau [24][33]. Với gen VKORC1, ngồi
phương pháp giải trình tự gen trực tiếp thì đa số các nghiên cứu của các nhóm tác giả khác đều sử dụng phương pháp RFLP [31]. Nghiên cứu của tác giả Harrington và cs (2008) từ Vương Quốc Anh cũng sử dụng enzym cắt Hinf để xác định trình tự của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 [37]. Và nghiên cứu của tác giả Chua Y.A et al (2015) tại Malaysia cũng sử dụng enzym Msp1 để cắt SNP rs9923231 trên gen
VKORC1 [112]. Kết quả nghiên cứu của những nhóm tác giả này cũng tương đồng
so với kết quả nghiên cứu này của chúng tôi.
4.3. Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934348 trên gen VKORC1 rs9923231, SNP rs9934348 trên gen VKORC1
Trong nghiên cứu của chúng tôi SNP CYP2C9*3 được xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự gen. Cịn SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 được xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP. Kết quả xác định kiểu
gen của 3 đa hình như sau:
SNP CYP2C9*3
Với SNP CYP2C9*3 kết quả nghiên cứu với cỡ mẫu n=100 của chúng tơi cho thấy: có tới 96% bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA và chỉ có 4% bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AC, đặc biệt trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu của chúng tôi chưa thấy xuất hiện bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến CC.
Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3: alen C chiếm tỉ lệ rất thấp (0,02) so với alen A (0,98).
Biểu đồ 4.1. Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 ở một số quần thể người khác nhau
(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6040167/)
Tần số alen C xuất hiện rất ít ở các quần thể người ở các quốc gia như: Swendish (0,007%), Việt Nam (trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ thấy xuất hiện tần số alen C là 2%). Tuy nhiên, tần số alen C lại xuất hiện nhiều hơn ở các quần thể người như ở German (5%), Caucasian (5,8%). Như vậy có thể kết luận được rằng sự phân bố alen của SNP CYP2C9*3 phụ thuộc vào sự khác nhau giữa các khu vực, các quốc gia, chủng tộc.
SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Với SNP rs9923231 trên gen VKORC1 kết quả xác định kiểu gen của SNP này