Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các bước nghiên cứu
2.4.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
2.4.3.1. Tách chiết DNA tổng số
- Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý của kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; Loại bỏ tạp chất trên màng silica- gel với Wash Buffer; Thu nhận DNA. Trước khi tách, lấy mẫu giã đông từ từ trên đá hoặc trong tủ mát. Khi mẫu đã giã đơng hồn tồn mới được sử dụng để tiến hành tách DNA tổng số.
- Quy trình tách DNA tổng số bằng kit E.Z.N.A blood DNA Mini Kit: 1. Lắc đều ống máu. Chuyển 250 µl mẫu vào ống epp 1,5 ml vô trùng. 2. Thêm 25 µl OB Protease Solution và 250 µl BL Buffer. Vortex 10 giây 3. Ủ 650C trong 10 phút. Chú ý: sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15s 4. Thêm 260 µl Ethanol 100%. Vortex trong 20 giây
5. Ly tâm 1000 v/p trong 15s để đảm bảo mẫu khơng dính trên thành ống Chú ý: Tất cả các bước ly tâm phải cân và đối trọng các mẫu ly tâm
6. Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml 7. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl)
8. Ly tâm 14.000 vịng/phút trong 1 phút 9. Bỏ dịch lọc và Collection Tube
10. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml mới 11. Thêm 500 µl HBC Buffer
12. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút 13. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube 14. Thêm 700 µl DNA Wash Buffer
15. Ly tâm trong 14.000 vòng/phút trong 1 phút 16. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube
17. Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer 18. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 v/p trong 2 phút 19. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới
20. Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 650C). Ủ 650C, 5 phút. 21. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
22. Thêm 50 µl Elution Buffer, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 23. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
24. Thu và bảo quản DNA ở -300C.
2.4.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang
Các mẫu sau khi tách DNA tổng số đều được kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang ở bước sóng A260 nm và A280 nm để đánh giá nồng độ DNA và độ tinh sạch của DNA. Phương pháp này sử dụng máy đo quang phổ nồng độ nano, Nano Photometer-implen NP80. Quy trình thao tác chung gồm các bước sau:
- Đo Blank: đo với 2 µl mơi trường dùng để bảo quản mẫu DNA tổng số. - Đo mẫu DNA: đo với 2 µl mẫu DNA tổng số vừa thu được.
Mỗi mẫu phải đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu.