Chƣơng 3 KẾT QUẢ
3.2. Kết quả phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,
3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,
rs9934438 trên gen VKORC1
3.2.4.1. Kết quả phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 bằng phương pháp giải trình tự
SNP CYP2C9*3 khơng có vị trí cắt đặc hiệu, do đó khơng thể dùng phương
pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP này. Nên đối với SNP này chúng tơi chỉ dùng phương pháp giải trình tự gen để xác định kiểu gen.
Dùng 25 µl sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa SNP CYP2C9*3 lên băng điện di đặc hiệu, có nồng độ tối thiểu là 20 ng/µl, tinh sạch và gửi giải trình tự tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được mở bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, dựa vào ảnh giải trình tự thu được, chúng tôi s xác định được kiểu gen của SNP CYP2C9*3.
Trình tự vùng gen chứa SNP CYP2C9*3 là:
GTGGTGCACGAGGTCCAGAGATAC[A/C]TTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGC
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự SNP CYP2C9*3
Đối với SNP CYP2C9*3 kết quả giải trình tự gen thể hiện qua hình ảnh giải
trình tự: các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và khơng có tín hiệu nhiễu, kết quả các kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử AA và kiểu gen dị hợp tử AC. Trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu của chúng tôi chưa thấy xuất hiện bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CC.
3.2.4.2. Kết quả phân tích kiểu gen SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp RFLP, đối chiếu với phương pháp giải trình tự
Kết quả xác định kiểu gen SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 bằng phương pháp RFLP
Phân tích kiểu gen sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1. Vì hai SNP này có vị trí cắt đặc hiệu với enzym cắt
giới hạn. Sản phẩm sau khi PCR s được tinh sạch và pha lỗng hoặc cơ đặc để đạt nồng độ 40 - 50 ng/µl và tiến hành RFLP theo quy trình đã được tối ưu (Bảng 2.2 và Bảng 2.3).
Kết quả sản phẩm RFLP của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 được kiểm tra bằng phương pháp điện di (quy trình điện di tương tự với
quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR mục 2.4.5.2). Kết quả kiểu gen được đọc dựa trên ảnh điện di.
- SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Hình 3.10. Sản phẩm RFLP của SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Kết quả RFLP của SNP rs9923231 trên gen VKORC1: hình ảnh các băng điện di r n t, đặc hiệu. Kết quả điện di cho thấy enzym cắt sử dụng cho alen là đặc hiệu, các yếu tố của phản ứng cắt đã được tối ưu tốt. Kết quả RFLP cho 3 kiểu gen:
+ Kiểu gen đồng hợp tử (AA) cho một băng điện di duy nhất kích thước: 771 bp. + Kiểu gen đồng hợp tử (GG) điện di cho hai băng có kích thước: 493 và 278 bp. + Kiểu gen dị hợp tử (AG) cho ba băng điện di có kích thước: 771; 493 và 287 bp.
- SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Hình 3.11. Sản phẩm RFLP của SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Làn M: Marker 100 - 4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm
Kết quả RFLP của SNP rs9934438 trên gen VKORC1: hình ảnh điện di cho thấy các băng điện di rõ nét, không bị smear. Như vậy, enzym cắt sử dụng là đặc hiệu, các yếu tố của phản ứng cắt đã được tối ưu tốt. Kết quả RFLP cho ba kiểu gen: + Đồng hợp tử (AA) điện di cho hai băng kích thước: 417 và 297 bp.
+ Kiểu gen đồng hợp tử (GG) điện di cho một băng có kích thước: 714 bp.
+ Kiểu gen dị hợp tử (AG) điện di cho ba băng có kích thước: 714; 417 và 297 bp.
Kết quả giải trình tự SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 đều có thể phân tích kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự gen. Dùng 25 µl sản phẩm PCR của phản ứng nhân vùng gen chứa SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 lên băng điện di đặc hiệu, có nồng độ tối thiểu là 20 ng/µl, tinh sạch và gửi giải trình tự tại hãng First Base (Malaysia) Kết quả giải trình tự gen được mở bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, để đọc được kết quả kiểu gen chúng tơi dựa vào ảnh giải trình tự thu được.
- Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1 Trình tự vùng gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 là: CCATTGGCC[A/G]GGTGCGGTGG.
Hình 3.12. Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1
Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1 được thể hiện qua ảnh giải trình tự: sản phẩm giải trình tự rõ nét, các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng, khơng có tín hiệu nhiễu. Kết quả giải trình tự gen xác định được ba kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG, kiểu gen dị hợp tử: AG, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA.
- Kết quả giải trình tự SNP rs9934438 trên gen VKORC1 Trình tự vùng gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là:
CCGACCTCCCATCCTAGTCCAAG[A/G]GTCGATGATCTCCCTGGCACCGG
Hình 3.13. Kết quả giải trình tự SNP rs9934438 trên gen VKORC1
Kết quả giải trình tự gen SNP rs9934438 trên gen VKORC1 được thể hiện qua ảnh giải trình tự: sản phẩm giải trình tự r n t. Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và khơng có tín hiệu nhiễu. Kết quả giải trình tự gen xác định được ba kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG, kiểu gen dị hợp tử: AG và kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA.
So sánh kết quả xác định kiểu gen của hai SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở 20 mẫu nghiên cứu đầu tiên sử dụng phương pháp giải trình tự gen và phương pháp RFLP chúng tôi nhận thấy kiểu gen của cả 20 mẫu này đều tương đồng hoàn toàn khi thực hiện xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP và phương pháp giải trình tự gen. Mặc dù phương pháp giải trình tự gen được coi là tiểu chuẩn vàng trong việc phát hiện các đa hình thái đơn gen (SNP). Tuy nhiên, thực hiện phương pháp này địi hỏi chi phí cao và tốn nhiều thời gian. Do đó, chúng tơi s sử dụng phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 với các mẫu tiếp theo trong nghiên cứu để giảm chi
phí, tiết kiệm thời gian cho bệnh nhân và giảm thời gian cho nghiên cứu.