Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các bước nghiên cứu
2.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP
rs9934438-F GGTGCCTTAATCCCAGCTACTC 714 rs9934438-R AAAGACTCCTGTTAGTTACCTCC
2.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR
2.4.5.1. Nguyên lý
Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn. Nguyên lý của kỹ thuật là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên các DNA mới từ DNA khuôn ban đầu. Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khn, mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase. Gồm 3 giai đoạn chính:
- Giai đoạn biến tính: dùng nhiệt độ cao (980C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép [12].
- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mồi như trình tự và số lượng nucleotide của mồi [12].
- Giai đoạn kéo dài: tại 720C DNA polymerase s hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại dNTP [12].
Để có quy trình khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu đặc hiệu và ổn định thì nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ của DNA và nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR cần phải được xác định, tối ưu chuẩn xác.
2.4.5.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR
Chất lượng sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose với quy trình tiến hành như sau:
- Nồng độ gel agarose sử dụng: 1,5% (1,5 g agarose pha trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1 X).
- Điện di gel agarose trong đệm TAE 1 X, hiệu điện thế 100 V, trong vòng 45 phút. Sử dụng hệ thống máy điện di MultiSub Choice, Cleaver Scientific, Bỉ.
- Dùng thang chuẩn: Marker 100 - 4 kb Plus (Lonza).
- Thể tích mẫu điện di: 5 µl sản phẩm sau PCR + 1 µl dye 6 X; 5 µl Marker 100 - 4 kb Plus (Lonza) (thường tra ở giếng đầu tiên để kiểm tra độ chính xác kích thước các băng điện di).
- Kết quả: hình ảnh điện di được ghi lại bằng hệ thống chụp ảnh điện di Gel- DocItx.
Mẫu PCR có chất lượng tốt là những mẫu có băng điện di sáng, rõ nét, không bị smear, đứt đoạn, khơng xuất hiện băng phụ và đúng với kích thước theo lý thuyết của SNP sau khi so sánh với thang chuẩn (Marker).