V. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHÔNG OXI CỦA CÁC DỊCH TRÍCH TỪ THựC VẬT
4.Phương pháp xác định hoạt tính chông oxỉ hóa của các dịch trích từ thực vật 1.Pha chế hóa chất
4.1. Pha chế hóa chất
> Chuẩn bị hóa chất
2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) FeS04.7H20
CH3COONa, CH3COOH
> Pha chế hóa chất
• Dung dịch đệm acetate: 300 mM, pH=3,6
1, 886 gCH3COONa
16 ml dung dịch acid acetic 99,5%
Định mức đến 1 lít bằng nước cất Kiểm tra pH, bảo quản lạnh
• Dung dịch HC1 loãng: 40 mM
3,38 mi dung dịch HC1 đậm đặc 37% (11,8 N) Định mức đến 1 lít bằng nước cất Bảo quản ở nhiệt độ phòng
• TPTZ(2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine): 10 mM 0,031 g TPTZ trong 10 ml dung dịch HC1 40mM Dung dịch này được chuẩn bị hàng ngày.
• FeCl3: 20mM
0,0415 gFeCl3.6H20 Hòa tan trong 10 ml nước cất
• Dung dịch chuẩn Chuẩn bị dung dịch 1 mM
0,278 g FeS04.7H20 trong 1 lít nước cất
Từ dung dịch chuẩn lmM này, pha loãng 5 lần dùng để xây dựng đường chuẩn
• Chuẩn bị tác nhân FRAP
200 ml đệm acetate 20 ml TPTZ 20 ml FeCl324 ml nước cất Chuẩn bị hàng ngày, bảo quản lạnh khi chưa sử dụng.
4.2. Cách thức tiến hành
Sau thời gian trích ly, đem các dịch trích đi ly tâm lạnh ở 4000 vòng trong thời gian 15 phút. Mục đích của ly tâm lạnh là tăng cường khả năng kết lắng của các tạp chất và giảm độ bay hơi cho dung môi để kết quả đo đạt được chính xác.
Sau khi ly tâm, dùng micripipette hút lml dịch trích cho vào ống nghiệm, tiến hành pha loãng dịch trích trong nước đến nồng độ thích hợp.
Sau khi pha loãng, dùng micropipette hút lml dịch trích cho vào ông nghiệm, thêm vào đó 2 ml tác nhân FRAP + 2ml nước cất. Để hỗn hợp phản ứng trong lh rồi đem đi đo độ hấp thu ở bước sóng 593nm.
Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng chỉ chứa 2ml tác nhân FRAP + 3ml nước cất.
Chuẩn bị mẫu đối chứng(cQx\ưo\y. mẫu đôi chứng được chuẩn bị như mẫu thí nghiệm nhưng thay lml mẫu thí nghiệm bằng lml dung môi. Chú ý rằng, nếu dịch trích pha loãng trong nước bao nhiêu lần thì dung môi cũng phải pha loãng trong nước bấy nhiêu lần, nghĩa là hệ sô" pha loãng của dung môi phải bằng hệ số pha loãng của dịch trích.
Đôi với các dịch trích trong dung môi diethyl ether là quá trình chuẩn bị khác đi một ít. Dịch trích này được pha loãng trong diethyl ether đến nồng độ thích hợp rồi hút lml dịch trích này cho vào ông nghiệm, thêm vào 2ml tác nhân FRAP, lắc mạnh, rồi thêm vào 2ml dung môi diethyl ether. Để hỗn hợp phản ứng trong lh rồi đem đi đo quang phổ. Mau đôi chứng gồm lml diethyl ether + 2ml tác nhân FRAP + 2ml nước cât.
STT Mẩu trắn g 1 2 3 4 5 6 Mẫu 1 Mẩu 2 Mẩu đôi chứ n ơ & Vchuẩn(ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 V mẫu(rnl) 1 1 Vdung môi(ml) 1 VH2o(ml) 3 2,9 2,8 2,6 2,4 2,2 2 2 2 2 VFRAP(HII) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 OD (593 nm) 4.3. Công thức tính
Từ kết quả đo dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn Fe2+ y= f(x) với y là mật độ quang, X là nồng độ Fe2+ (mmol Fe2+/L). Tính độ lệch chuẩn R2 của đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ Fe2+ trong mẫu đo quang học M (mmol Fe2+/L). Hoạt tính chồng oxi hóa trong nguyên liệu được tính như sau:
AA _ M.f.v Too
1000 'm.(l 00-00
AA: hoạt tính chông oxi hóa trong nguyên liệu (mmol Fe2+/g chất khô) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M: nồng độ Fe2+ trong mẫu đo quang học = hoạt tính chông oxi hóa trong mẫu đo quang học (mmol Fe2+/L) f: hệ sô" pha loãng
V: thể tích dung môi dùng trích ly chất chông oxi hóa (ml) m: khôi lượng mẫu đcm trích ly (g)
W: độ ẩm mẫu (%).
Chứ ý: Khi trích ly, không thể nào toàn bộ các chất chông oxi đều đi vào dung môi. Vì thế, công thức trên không xác định giá trị thực sự hoạt tính chông oxi hóa trong nguyên liệu mà chỉ là gần đúng.