CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THỨC CƠNG CẤU TẠO
CỦA TINH THỂ MÀU TRẮNG (TT)
Tinh thể màu trắng TT đƣợc phân lập bằng sắc kí cột trong dung mơi Chloroform.
Theo dõi quá trình sắc kí bằng phân tích SKBM, hiện hình bằng đèn UV cĩ bƣớc sĩng bằng 254 nm. Những lọ penicilin nào cĩ kết quả trên bản mỏng tƣơng tự nhau thì gộp chung vào một phân đoạn, thu đƣợc 2 nhĩm phân đoạn. Các nhĩm phân đoạn đƣợc kí hiệu là TT1 và TT2 : TT1 (1-27), TT2 (28-90).
Thổi nhẹ các phân đoạn thu đƣợc để bay hơi một phần dung mơi. Dùng mao quản chấm dịch mẫu ở các phân đoạn này và chạy SKBM với dung mơi Chloroform, hiện hình bằng UV, tơi nhận thấy ở phân đoạn TT1 hiện vệt rõ nét, ứng với giá trị Rf= 0,45 đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Cơ cạn các phân đoạn ta thu đƣợc kết quả ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Các phân đoạn sau khi cơ cạn của chất rắn kết tinh
Các phân đoạn Sản phẩm sau khi cơ cạn
TT1 Chất rắn màu trắng (80mg)
Hình 3.5. Sắc kí bản mỏng rồi hiện hình dưới đèn UV của hợp chất TT1
Hình 3.6. Chất rắn TT1 sau khi cơ cạn
Chất rắn TT1 sau khi phân lập đƣợc tiến hành định danh cấu trúc bằng các phƣơng pháp đo phổ: phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân prpton 1H-NMR, phổ khối lƣợng MS, đựợc đo tại Viện Hĩa học các hợp chất tự nhiên - Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam cho kết quả sau:
3.5.1. Kết quả đo phổ MS
[Type a quote from the document or the summary of an interesting point. You can position the text box anywhere in the document. Use the Drawing Tools tab to change the formatting of the pull quote text box.] H ìn h 3. 7 . P h ổ MS c ủa m ẫu ch ất r ắn TT 1 t hu đ ư ợc
Trên hình 3.7 cĩ một peak ứng với M+ của hợp chất TT1 ở m/z= 228, khối lƣợng này tƣơng ứng với khối lƣợng của hợp chất tơi dự đốn ban đầu là Tetradecanoic acid cĩ khối lƣợng phân tử là 228.
Để khẳng định điều này, tơi tiến hành phân mảnh phổ bằng chƣơng trình ChemSketch đƣợc trình bày ở hình 3.8 và bảng 3.9 OH CH3 O Molecular Formula = C14H28O2 Formula Weight = 228.37092 OH CH3 O C11H21O2 185.1542 Da C3H7 43.0548 Da OH CH2+ O m/z = 185.2826914 C7H13O2 129.0916 Da C4H8 56.0626 Da CH2+ OH O m/z = 129.1763714 C4H8 56.0626 Da C3H5O2 73.029 Da C H2 + OH O m/z = 73.0700514 CH2 14.0157 Da C2H3O2 59.0133 Da C H2 + OH O [M+H]+ = 60.020032 Da OH CH3 O C10H19O2 171.1385 Da C4H9 57.0704 Da OH CH2+ O C H2 + CH3 m/z = 57.1137114 C3H6 42.047 Da 15.0235 DaCH3 C H2 + CH2+ [M-H]- = 41.038577 Da C5H9O2 101.0603 Da CH2+ CH3 m/z = 71.1402914 C5H10 70.0783 Da m/z = 171.2561114
Bảng 3.14. Bảng phân mảnh axit TT Mảnh ion m/z 1 C14H27O2+ 228 2 C11H21O2+ 185 3 C10H19O2+ 171 4 C7H13O2+ 129 5 C5H9O2+ 101 6 C3H5O2+ 73 7 C5H10+ 70 8 C2H3O2+ 59 9 C4H9+ 57 10 C4H8+ 56 11 C3H6+ 42 12 CH3+ 15 13 CH2+ 14
Phổ cĩ độ phân giải cao, các peak song tách hồn tồn ra khỏi nhau. Các mảnh phân cắt này đều phù hợp với các peak phổ cĩ trong phổ đồ MS. Điều đĩ chứng tỏ hợp chất đƣợc phân lập là Tetradecanoic acid.
Để khẳng định lại một lần nữa nhận định đĩ là đúng thì tơi đã tiến hành đo phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1
H-NMR, 13
C-NMR.
3.5.2. Kết quả đo phổ hồng ngoại IR
H ìn h 3. 9 . P h ổ IR c ủa m ẫu c h ất r ắn TT 1 th u đư ợc
Tín hiệu phổ hồng ngoại (IR) đƣợc trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Phân tích phổ hồng ngoại IR của chất rắn TT1
STT νTT1 (cm-1)
νtheo tài liệu[12] (cm-1) Dự kiến nhĩm chức Chú thích 1 3600 3300-3600 -OH tự do của nhĩm acid Pic của nhĩm OH này cĩ chân rộng 2 2900 2960-2870 Hidro ankan (-CH3) 3 2800 2925-2850 Hidro acid (-CH2) 4 1700 1650-1800 -C=O Nhĩm cacbonyl trong acid Nhận xét:
- Các peak phía sau khơng cĩ dao động đặc trƣng của C-N, N-O, N-H, vì vậy cấu tử này khơng chứa N.
- Từ bảng 3.16 ta thấy phổ hồng ngoại của chất rắn TT1 thu đƣợc, cĩ các peak đặc trƣng cho nhĩm chức và liên kết tƣơng đồng về số sĩng theo tài liệu.
3.5.3. Kết quả đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân pronton 1H-NMR
H ìn h 3. 1 0 . P h ổ 1 H-N MR c ủa c h ất r ắn TT 1
Qua phổ 1H-NMR thấy chất nghiên cứu cĩ 35 proton. Tín hiệu phổ dựa vào độ dịch chuyển đƣợc trình bày ở bảng 3.16.
Bảng 3.16. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của chất rắn TT1
d (ppm) Nhĩm chức Ghi chú
H1 Thiếu H trong nhĩm OH của COOH, H
trong nhĩm này cĩ độ dịch chuyển khoảng >10 ppm là do sự trao đổi proton rất nhanh của COOH nên cĩ trƣờng hợp khơng thu đƣợc trên phổ proton
H2 ~2.3 Cacbonyl
(-CH2-CO-)
2 proton tƣơng đƣơng nhau của H2 ở trƣờng thấp do hiệu ứng chắn của CO(cacbon số 2, cacbon số 1 COOH cĩ chứa nhĩm cacbonyl C=O)
? ~1.64 2 proton này của H2 (cacbon số 2) bị
chuyển về trƣờng thấp do hiệu ứng chắn của nhĩm COOH, C2 nằm gần C1 (COOH) Hoặc cĩ thể nhĩm OH trong COOH. Nếu cĩ 1 proton , mà ở đây cĩ 2 proton tƣơng đƣơng
H2 H14
~1.3 R2CH2 28 proton tƣơng đƣơng nhau của H2-H14
(C2-C14)
Trong đĩ 2 proton bị chuyển về trƣờng cao (cĩ 2 mũi độ chuyển dịch 1.2 mấy, chƣa tới 3), 2 proton này của H13 (nằm gần nhĩm CH3)
H14 ~0.9 RCH3 Mũi 3, 3 proton tƣơng đƣơng của H14 (của cacbon số 14)
- Cĩ 3 proton cĩ d = 0.9 (peak nhỏ, chồng lên nhau, độ phân giải thấp, từ ppm 1.2 mà 0.9 là của nhĩm –CH3, trong này là C14 của Tetradecanoic acid) đặc trƣng cho 3 proton của nhĩm –CH3 thu đƣợc mũi 3, do sự tƣơng tác spin-spin của H13. Tín hiệu này thu đƣợc ở trƣờng cao do khơng bị hiệu ứng chắn của C1 (nhĩm –COOH) ảnh hƣởng. Từ đây kết luận đƣợc nhĩm –CH3 nằm cuối mạch, chỉ cĩ 1nhĩm duy nhất, cịn lại CH2 hết acid này khơng phân nhánh .
- Cĩ 28 proton tƣơng đƣơng cĩ d = ~1.3 cho tín hiệu rõ nhất ứng với các proton trong nhĩm –(CH2)n. Kết luận đƣợc acid cĩ 12 nhĩm CH2, mà 2 proton này tƣơng đƣơng nhau (vì peak khơng chẻ).
- Khơng cĩ proton >5ppm trở lên khơng cĩ proton liên kết với
cacbon mang nối đơi, vịng benzene chất đƣợc phân lập là tinh khiết,
khơng bị ảnh hƣởng bởi dung mơi.
- Khơng tìm đƣợc dữ kiện để kết luận cĩ nhĩm COOH (cĩ thể do proton trong COOH trao đổi rất nhanh), mới tìm đƣợc C=O CH3–(CH2)n – COOH.
Nhận xét:
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của hợp chất nghiên cứu xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng cho proton của nhĩm C=O, CH2, CH3.
3.5.4. Kết quả đo phổ 13C-NMR
H ìn h 3. 1 1 . P h ổ 13 C-N MR c ủa c h ất r ắn TT 1
Tín hiệu phổ 13 C-NMR đƣợc trình bày ở bảng 3.17 Bảng 3.17. Phân tích phổ 13 C-NMR của chất rắn TT1 Vị trí C δC ppm δH ppm Nhĩm nguyên tử 1 180 9 (1H, t) C 2 34 1.3 (2H, s) CH2 3 34 1.3 (2H, s) CH2 4 33 1.3 (2H, s) CH2 5 33 1.3 (2H, s) CH2 6 29 1.3 (2H, s) CH2 7 29 1.3 (2H, s) CH2 8 29 1.3 (2H, s) CH2 9 29 1.3 (2H, s) CH2 10 29 1.3 (2H, s) CH2 11 23 1.3 (2H, s) CH2 12 22 1.6 (2H, s) CH2 13 22 2.3 (2H, s) CH2 14 13 0.9 (3H, t) CH3
Trên phổ 13 C-NMR cĩ 14 tín hiệu, tƣơng ứng với 14C. Trong đĩ cĩ 13 tín hiệu cĩ độ dịch chuyển từ 0 – 40ppm của Cacbon no, khơng liên kết trực tiếp với Oxi (CH, CH2, CH3), 1 tín hiệu cĩ độ dịch chuyển lớn hơn 160 ppm của Cacbon khơng no liên kết trực tiếp với Oxi, ở đây là COOH (vì phổ 1H cĩ 1 proton cĩ độ dịch chuyển lớn hơn 10 ppm).
1 nhĩm CH3 (δ=13.730 ppm)
12 nhĩm CH2 (δ= 22, 22, 23, 29, 29, 29, 29, 29,29, 33, 33, 34 34 ppm) 1 nhĩm COOH (δ=180.24ppm)
Kết luận
Từ kết quả kiểm tra phổ MS kết hợp phổ 1H-NMR , 13C-NMR và phổ IR đồng thời so sánh với tài liệu tham khảo cho thấy các tín hiệu tƣơng tự nhau, một số đỉnh dao động đặc trƣng cĩ sự tƣơng đồng về số sĩng nhƣ vậy sản phẩm phân lập đƣợc cĩ cơng thức cấu tạo phù hợp với cơng thức Tetradecanoic Acid nhƣ dự đốn ban đầu (hình 3.13).
Vậy cĩ thể kết luận chất rắn TT1 là Tetradecanoic acid cĩ cơng thức:
Hình 3.12. Cơng thức cấu tạo của Acid Tetradecanoic
3.6. TETRADECANOIC ACID
- Tên IUPAC: Tetradecanoic Acid. - Tên thơng thƣờng: Acid Myristic. - Cơng thức phân tử: C14H28O2. - Cấu trúc hĩa học:
- Tetradecanoic Acid là một acid béo chuỗi dài bão hịa với một đƣờng trục 14-carbon, xảy ra ở hầu hết các chất béo động vật và thực vật, đặc
biệt là bơ và dừa, dầu cọ và dầu hạt nhục đậu khấu.
Nguồn gốc
- Myristic hiện diện với số lƣợng lớn hạt giống của các gia đình Myristicaceae (dầu hạt nhục đậu khấu - hoặc dầu gậy từ Myristica fragranschứa khoảng 60-70% của trimyristin), nơi lần đầu tiên đƣợc phát hiện (Playfair L Ann 1841, 37, 152). Hạt nhục đậu khấu đƣợc tìm thấy trong Moluccas và gia vị đảo In-đơ-nê-xi-a. Dừa và hạt cọ cũng là nguồn thuận tiện (trimyristine) cĩ thể đƣợc cơ lập trong một hình thức tinh khiết bằng cách chƣng cất. Nĩ cũng cĩ mặt trong chất béo sữa (8-12%) và dầu đầu của con cá voi tinh trùng (15% ). Dƣ thừa axit myristic trong chế độ ăn uống gây ra sự gia tăng cholesterol trong huyết tƣơng ở động vật và con ngƣời. Trong số các axit béo bão hịa, chỉ cĩ myristic cĩ thể làm cho một liên kết amide với một số protein của tế bào (myristoylation), sửa đổi chỉnh các hoạt động sinh học của họ.
Cơng dụng
- Tetradecanoic Acid là chất chống oxy hĩa, ngăn ngừa ung thƣ, chất bơi trơn. Hạ cholesterol, cầm máu, trị giun trịn, kháng khuẩn.
- Tetradecanoic Acid đƣợc dùng để tổng hợp hƣơng vị nên thƣờng đƣợc sử dụng đƣợc sử dụng trong mỹ phẩm, sữa tắm và các chế phẩm bơi thuốc nơi tốt hấp thụ qua da một cách hồn hảo .
- Tetradecanoic Acid đƣợc thêm đồng translationally để áp chĩt, nitơ- ga cuối, glycine ở thụ thể liên kinase để trao các địa hĩa màng của các enzyme. Các acid myristic cĩ đủ cao kỵ nƣớc để trở thành đƣa vào béo acyl cốt lõi của các phospholipid kép của màng plasma của các nhân điển hình di động. Bằng cách này, axit myristic đĩng vai trị nhƣ một neo lipid trong màng sinh học.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Qua nghiên cứu thực nghiệm, tơi đã xác định đƣợc một số thơng số hĩa lí của nguyên liệu bột lá cây:
+ Độ ẩm trung bình của lá cây Rẻ quạt khơ là 15.942%
+ Hàm lƣợng tro trung bình của lá cây Rẻ quạt khơ là 5.083%
+ Hàm lƣợng kim loại nặng là Cu (6.72mg/kg), Zn (15.75mg/kg), Pb (0.3mg/kg), As(0.026mg/kg), Hg(<0.05mg/kg)
- Xác định đƣợc thời gian tối ƣu nhất để thu các dịch chiết với hàm lƣợng cao nhất nhƣ sau:
+ Dung mơi n-hexane: thời gian chiết tốt nhất là 8 tiếng với tỷ lệ phần trăm khối lƣợng cao chiết ra là 2.75%;
+ Dung mơi ethyl acetate thời gian chiết tốt nhất là 10 tiếng với tỷ lệ phần trăm khối lƣợng cao chiết ra là 8.43%;
+ Dung mơi dichloromethane thời gian chiết tốt nhất là 10 tiếng với tỷ lệ phần trăm khối lƣợng cao chiết ra là 6.36%;
+ Dung mơi methanol thời gian chiết tốt nhất là 8 tiếng với tỷ lệ phần trăm khối lƣợng cao chiết ra là 9.09%.
- Định danh đƣợc thành phần một số cấu tử cĩ trong lá cây Rẻ quạt. Tổng số cấu tử định danh đƣợc là 21 cấu tử. Cĩ một số cấu tử hàm lƣợng cao định danh đƣợc cĩ hoạt tính sinh học là phenolic, aldohexoes, isoflavonoit. Trong 4 dịch chiết cĩ chung cấu tử Palmitic acid với hàm lƣợng ở các dịch chiết đều tƣơng đối cao.
- Đã phân lập và xác định đƣợc một cấu tử tinh khiết là Tetradecanoic acid. Đây là lần đầu tiên cấu tử này đƣợc phân lập từ lá cây Rẻ quạt.
2. Kiến nghị
Do thời gian nghiên cứu cĩ hạn, thơng qua kết quả của đề tài tơi mong muốn đề tài đƣợc phát triển rộng hơn về một số vấn đề sau:
- Tiếp tục nghiên cứu chiết tách Tetradecanoic Acid từ lá cây Rẻ quạt bằng các dung mơi hữu cơ khác để so sánh và đƣa ra dung mơi tốt hơn nữa để quá trình chiết tách đạt hiệu quả cao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1] BVN - BotanyVN - Botany Research and Development Group of Vietnam.
[2] Bộ y tế (2012), Từ điển Cây thuốc Việt Nam (bộ mới), tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
[3] Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thơng dụng, tập 1, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
[4] Nguyễn Tinh Dung (2000), Hĩa học phân tích, Phần III - Các phƣơng
pháp phân tích định lƣợng hĩa học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
[5] Nguyễn Văn Đàn (1987), Phương pháp nghiên cứu Hĩa học cây thuốc, NXB Y học, Hà Nội.
[6] TS. Lê Minh Hà (2012), Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên. “Nghiên cứu chiết tách các hợp chất isoflavonoids từ cây Rẻ quạt ứng dụng trong điều trị các bệnh ho, viêm họng”.
[7] Phạm Thị Lan Hƣơng (2007), Bài giảng mơn vi sinh thực phẩm -
Chƣơng 3, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội.
[8] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
[9] Nguyễn Thành Trung (2012), Nghiên cứu chiết tách và xây dựng phương pháp xác định hàm lượng hợp chất Tectoridin trong cây Rẻ quạt ( Belamcanda chinensis L.), Hà Nội.
[10] Đồn Minh Tuấn (2015), Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần
hĩa học một số dịch chiết rễ cây Rẻ quạt, Khĩa luận tốt nghiệp.
Tài liệu nƣớc ngồi
[11] Chevallier. A (1996), “The Encyclopedia of Medicinal Plants”, Dorling Kindersley, London ISBN 978-0-7513-0314-8.
[12] Chopra. R. N., Nayar. S. L. and Chopra. I. C (1986), Glossary of Indian
Medicinal Plants (Including the Supplement), Council of Scientific
and Industrial Research, New Delhi.
[13] Chongming Wu, Jingyao Shen , Pingping He, Yan Chen, Liang Li, Liang Zhang, Ye Li, Yujuan Fu, Rongji Dai, Weiwei Meng and Yulin Deng (2012), “The α-Glucosidase Inhibiting Isoflavones Isolated from Belamcanda chinensis Leaf Extract”, Rec. Nat. Prod.
6:2, 110-120.
[14] Dorota Wozniak, Bogdan Janda, Ireneusz Kapusta, Wiestaw Oleszekb, Adam Matkowski (2010), “Antimutagenic and anti-oxidant activities of isoflavonoids from Belamcanda chinensis (L.) DC”, Mutation Research 696, 148-153.
[15] Fumiko Abe, Rong-Fu Chen, Tatsuo Yamauchi (1991), “Iridals from Belamcanda chinensis and Iris japonica”, Phytochemistry, vol.30,
no.10, 3379 - 3381.
[16] Goldblatt, Peter; John Manning (2008), “The Iris Family: Natural History & Classification”, Portland: Timber Press., ISBN 978-0-
88192-897-6.
[17] Hideyuki Ito, Satomi Onoue, Yoko Miyake, and Takashi Yoshida (1999), “Iridal-type triterpenoids with Ichthyotoxic Activity from Belamcanda chinen”, J. Nat. Prod., 62 (1), pp 89–93.
[18] Isabella Aiona Abbott "Sisyrinchium acre -Traditional Hawaiian Uses of Plants", page 128.
[19] Ito H, Onoue S, Yoshida T (2001), “Isoflavonoids from Belamcanda chinensis”, Chem Pharm Bull (Tokyo), 49 (9):1229-31.
[20] Jun Li, Winnie Z.M. Li, Wen Huang, Anna W.H. Cheung, Cathy W.C. Bi, Ran Duan, Ava J.Y. Guo, Tina T.X. Dong, Karl W.K. Tsim
(2009), “Quality evaluation of Rhizoma Belamcandae (Belamcanda chinensis (L.) DC.) by using high-performance liquid chromatography coupled with diode array detector and mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, Vol.1216 (11), 2071. [21] Min-Jian QIn, Wen-Liang JI, Zheng-Tao WANG, Wen-Cai YE (2005),
“A New Isoflavonoid from Belamcanda chinensis (L.) DC”, Journal
of Integrative Plant Biology, Volume 47, Issue 11, pages 1404–1408.
[22] Monthakantirat O, De-Eknamkul W, Umehara K, Yoshinaga Y, Miyase T, Warashina T, Noguchi H (2005), “Phenolic Constituents of the Rhizomes of the Thai Medicinal Plant Belamcanda chinensis with Proliferative Activity for Two Breast Cancer Cell Lines” J Nat Prod., 68 (3):361-4.
[23] Oh KB, Kang H, Matsuoka H (2001), “Detection of Antifungal Activity in Belamcanda chinensis by a Single-cell Bioassay Method and Isolation of Its Active Compound”, Tectorigenin, 65 (4):939-42. [24] Sang Hoon Jung, Yeon Sil Lee, Soon Sung Lim, Sanghyun Lee, Kuk
Hyun Shin and Yeong Shik Kim, “Antioxidant Activities of Isoflavones from the Rhizomes of Belamcanda chinensis on Carbon Tetrachloride- Induced HepaticInjury in Rats”, Arch Pham Res Vol
27, No2, 184-188.
[25] Seidlová-Wuttke D, Hesse O, Jarry H, Rimoldi G, Thelen P, Christoffel