6. Cấu trúc luận văn
2.2. THIẾT BỊ DỤNG CỤ HĨA CHẤT
2.2.1. Thiết bị - dụng cụ
- Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhơm tráng sẵn silicagel 60GF254, độ dày 0,2mm và bản mỏng ngƣợc pha Rp–18.
- Phân lập các chất bằng phƣơng pháp sắc kí cột với chất hấp phụ là silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck hoặc Sephadex LH–20.
LC/MSD Agilent. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H–NMR, đo trên máy Bruker Avance–500 MHz. Phổ hồng ngoại (FT–IR) đo dƣới dạng viên nén KBr trên trên máy quang phổ IMPACT 410 của hãng Nicolet, Hoa Kì.
- Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bƣớc sĩng λ = 360nm.
- Ngồi ra cịn dùng một số trang thiết bị khác nhƣ máy quay cất chân khơng, máy sấy, cân phân tích, bếp cách thủy, bếp điện.
-Dụng cụ thủy tinh: cốc thủy tinh, bình tam giác, bình cầu 500ml, 1000ml, sinh hàn hồi lƣu, ống đong, sinh hàn thẳng, ống sừng bị, ống nối, ống nghiệm, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc, ca nhựa, cột sắc kí, bộ chiết Soxhlet 250ml, v.v...
Hình 2.3. Máy cất quay chân khơng và đèn tử ngoại UV (BIOBLOCK)
2.2.2. Hĩa chất
- Nƣớc cất, n-hexane, chloroform, ethyl acetace, diethyl eter, dichloromethan, methanol
2.3. MỘT SỐ KĨ THUẬT SỬ DỤNG ĐỂ CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
- Mẫu thực vật thƣờng đƣợc chiết theo phƣơng pháp chiết rắn – lỏng. Phƣơng pháp này cĩ nhiều kĩ thuật chiết nhƣ: kỹ thuật chiết ngấm kiệt, kỹ thuật chiết ngâm dầm, kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet, kỹ thuật chiết bằng lơi cuốn hơi nƣớc, kĩ thuật chiết chƣng ninh,...
2.3.1. Phƣơng pháp chiết Soxhlet
a. Cấu tạo bộ chiết Soxhlet
Bộ chiết Soxhlet mơ tả ở Hình 2.4 đƣợc cấu tạo gồm ba bộ phận tháo ráp đƣợc tại các vị trí nút mài (1), (2) và (3). Gồm:
Bình cầu A đặt trong một bếp đun cĩ thể điều chỉnh nhiệt độ;
Bộ phận chứa mẫu bột cây, gồm ba ống: Ống D cĩ đƣờng kính lớn, ở giữa, để chứa bột cây; ống B cĩ đƣờng kính trung bình, để dẫn dung mơi từ bình A bay lên, đi vào ống D chứa bột cây; ống E cĩ đƣờng kính nhỏ, là ống thơng nhau, để dẫn dung mơi từ D trả ngƣợc lại bình cầu A.
Trên cao nhất là ống sinh hàn C, cĩ nhiệm vụ ngƣng hơi.
Hình 2.4. Sơ đồ cấu tạo bộ chiết Soxhlet
b. Một số lưu ý khi chiết Soxhlet
- Các hợp chất chiết đƣợc trữ trong bình cầu A, đến một lúc khi nồng độ của chất đạt đến mức bão hịa thì cần phải thay dung mơi mới.
- Tùy trƣờng hợp, việc chiết cĩ thể kéo dài trong vài ngày. Khi nghỉ, ra về, cần tắt bếp điện trƣớc, chờ thêm ba mƣơi phút sau đĩ mới tắt nguồn nƣớc làm lạnh ống ngƣng hơi.
nghiệm ở xứ nĩng, cần lƣu ý xem ống ngƣng hơi cĩ đủ sức làm ngƣng tụ hay khơng, nếu khơng, sẽ thấy khí bốc ra khỏi hệ thống từ đầu trên cao của ống ngƣng hơi. Trong trƣờng hợp đĩ, cần tìm cách nối dài thêm ống ngƣng hơi. Lƣu ý đây là hệ thống hở, phần bên trong của ống thơng với khơng khí bên ngồi nhờ ống ngƣng hơi, vì thế khi nối dài ống ngƣng hơi khơng làm ống bị bít.
- Sau khi chiết kiệt với một loại dung mơi, ví dụ nhƣ ete dầu hỏa, nếu muốn tiếp tục chiết với một dung mơi cĩ tính phân cực hơn, ví dụ cloroform, thì ta rút bao chứa bột cây ra khỏi ống D, mở miệng bao cho dung mơi bay hết rồi mới cho bao vào trở lại ống D, rĩt dung mơi là cloroform vào, bắt đầu quá trình chiết mới.
c. Ưu, nhược điểm của hệ thống
-Ƣu điểm
+Tiết kiệm dung mơi, chỉ một lƣợng ít dung mơi mà chiết kiệt đƣợc mẫu cây. Khơng phải tốn cơng lọc và châm dung mơi mới;
+Khơng tốn các thao tác lọc và châm dung mơi mới nhƣ các kĩ thuật chiết khác. Chỉ cần cắm điện, mở nƣớc hồn lƣu là máy sẽ thực hiện sự chiết;
+Chiết kiệt hợp chất trong bột cây vì bột cây luơn đƣợc liên tục chiết bằng dung mơi tinh khiết.
-Nhƣợc điểm
+Kích thƣớc của máy Soxhlet làm giới hạn lƣợng bột cây cần chiết. Máy loại lớn nhất với bình cầu dung tích 15 lít, cĩ thể chiết một lần đến 10 lít dung mơi; ống D cĩ thể chứa 800gam bột cây xay mịn. Với máy nhỏ hơn, chỉ cĩ thể cho vào mỗi lần vài trăm gam bột cây, muốn chiết lƣợng lớn bột cây cần phải lặp lại nhiều lần.
+Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột cây đƣợc trữ lại trong bình cầu A nên chúng luơn bị đun nĩng ở nhiệt độ sơi của dung mơi, vì
thế nếu cĩ hợp chất nào kém bền nhiệt nhƣ carotenoid cĩ thể bị hƣ hại.
-Do tồn bộ hệ thống của máy đều bằng thủy tinh và đƣợc gia cơng thủ cơng nên giá thành một máy khá cao. Máy bằng thủy tinh nên dễ vỡ, trong đĩ các bộ phận của máy, nhất là các nút mài do đƣợc gia cơng thủ cơng nên chỉ cần làm bể một bộ phận nào đĩ thì khĩ tìm đƣợc một bộ phận khác cĩ thể vừa khớp để thay thế.
2.3.2. Phƣơng pháp chiết tách chƣng ninh
Tuy là phƣơng pháp đơn giản nhƣng việc lựa chọn dung mơi cũng hết sức nghiêm ngặt. Dung mơi sử dụng phải thỏa mãn các điều kiện sau:
- Hịa tan tốt các cấu tử cần chiết tách, khơng hịa tan hay hịa tan rất ít các cấu tử khác. Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu bắt buộc phải cĩ.
- Khơng tƣơng tác với các cấu tử hĩa học cần chiết tách.
- Khơng gây độc hại cho ngƣời sử dụng và thân thiện với mơi trƣờng. - Dễ kiếm, giá thành rẻ.
- Khơng cĩ tƣơng tác, phá hủy dụng cụ cần chiết tách.
2.3.3. Phƣơng pháp tách và tinh chế chất
Cao chiết thu đƣợc đƣợc tách và tinh chế bằng phƣơng pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các đơn hoặc hệ dung mơi thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thƣờng và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel. Đối với các chất phân cực cĩ thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngƣợc pha Rp–18. Trƣờng hợp cần thiết cĩ thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng nhƣ theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với đơn hoặc hệ dung mơi thích hợp.
Phƣơng pháp kết tinh lại
Kết quả cuối cùng của quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế là phải thu đƣợc tinh thể nguyên chất, ngoại trừ các hợp chất lỏng.
Đây là phƣơng pháp quan trọng nhất để tinh chế các chất rắn. Cơ sở lí thuyết của phƣơng pháp là dựa vào sự khác nhau về độ tan của các chất trong một dung mơi hay hệ dung mơi ở các nhiệt độ khác nhau, cũng nhƣ sự khác nhau về độ tan vào dung mơi của chất tinh chế và chất bẩn ở cùng một nhiệt độ. Quá trình chung là hịa tan chất rắn thành dung dịch bão hịa ở nhiệt độ sơi của dung mơi và khi để lạnh thì chất rắn kết tinh lại dƣới dạng tinh khiết.
Các bƣớc của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung mơi, hịa tan nĩng và lọc, để kết tinh ở lạnh, gạn tinh thể ra khỏi dung dịch mẹ và làm khơ tinh thể.
Trong các bƣớc trên việc chọn dung mơi thích hợp cĩ tầm quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh [2].
a. Chọn dung mơi
Việc lựa chọn dung mơi kết tinh rất quan trọng, hợp chất càng tinh khiết thì việc xác định cấu trúc càng chính xác, độ tinh khiết của hợp chất cần phải >95%.
Lựa chọn dung mơi tinh khiết dựa vào mối quan hệ cấu tạo phân tử của chất cần kết tinh và dung mơi kết tinh, thƣờng chất phân cực thì hịa tan vào dung mơi phân cực và ngƣợc lại. Khi chất kết tinh chƣa rõ cấu tạo thì phải thử hịa tan trong dung mơi từ khơng phân cực đến dung mơi phân cực.
Dung mơi phân cực thỏa mãn một số điều kiện sau:
- Hịa tan càng nhiều càng tốt chất cần kết tinh ở nhiệt độ sơi và càng ít càng tốt ở nhiệt độ thấp.
- Hịa tan càng ít càng tốt các tạp chất ở nhiệt độ sơi và càng nhiều càng tốt ở nhiệt độ thấp.
- Khơng tƣơng tác hĩa học với chất kết tinh ở nhiệt thƣờng cũng nhƣ nhiệt độ sơi.
độ sơi tƣơng đối cao, khoảng cách giữa nhiệt độ sơi của nĩ với nhiệt độ thƣờng càng xa thì càng cĩ nhiều thời gian để hình thành tinh thể; nhƣng cũng khơng nên cao quá vì sẽ khĩ bốc hơi trong quá trình kết tinh đồng thời nhiệt độ cao cĩ thể gây phân hủy chất kết tinh, độ sơi của dung mơi trong vịng 60- 800C là thích hợp) [3].
b. Cách xác đinh độ hịa tan một chất đối với dung mơi
Ở nhiệt độ thƣờng
- Lấy một loạt ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống nghiệm một lƣợng chính xác chất kết tinh khoảng 10-50mg.
- Dùng ống hút chia vạch 0,1ml lấy dung mơi cho vào với tinh thể lúc đầu ít, sau tăng dần đến khi hợp chất tan. Sau mỗi lần cho dung mơi lắc mạnh để ống hịa tan. Làm nhƣ vậy với các dung mơi khác nhau.
- Tỷ lệ giữa lƣợng chất rắn với thể tích dung mơi đủ để hịa tan hồn tồn là độ hịa tan của dung mơi ấy đối với chất rắn ở nhiệt độ thƣờng [3].
Ở nhiệt độ sơi
- Cách xác định độ hịa tan ở nhiệt độ sơi cũng tiến hành nhƣ trên nhƣng đun nĩng ống nghiệm bằng bếp cách thủy đến khi dung mơi sơi, quan sát sự hịa tan của các dung mơi đối với chất rắn.
- Khi khơng chọn đƣợc đơn dung mơi thì bắt buộc phải chọn hệ dung mơi. Nguyên tắc: lấy một dung mơi hịa tan chất kết tinh ở nhiệt độ thƣờng, sau đĩ chọn một dung mơi khơng hịa tan hoặc kém hịa tan chất tinh chế nhƣng phải tan trong dung mơi trên.
- Nếu cĩ nhiều chất cĩ độ tan khác nhau ở nhiệt độ khác nhau vào một dung dịch, ngƣời ta dùng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn. Ở một nhiệt độ xác định, một chất nào đĩ tan quá bão hịa sẽ kết tinh lại khi để lạnh, cịn chất kia chƣa bão hịa sẽ ở lại trong dung dịch.
sẽ lọc nĩng để loại bỏ chất bẩn, cịn chất kết tinh ở lại trong dung dịch sẽ kết tinh khi làm lạnh.
- Dung mơi đƣợc xem là tốt nếu đảm bảo dung mơi tan một phần chất rắn (hoặc tan hồn tồn càng tốt), để nguội sau đĩ cho vào tủ lạnh để yên thì chất rắn kết tinh lại; nếu dung mơi tan hồn tồn nhƣng để nguội chất rắn khơng kết tinh lại thì cĩ thể đƣợc xem là dung mơi kết tinh (trƣờng hợp cuối cùng để lựa chọn); cịn dung mơi khơng tan thì khơng đƣợc lựa chọn [3].
2.3.4. Kĩ thuật sắc kí bản mỏng
a. Nguyên tắc
- Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đƣợc dùng chủ yếu để định tính, ngồi ra cịn để thử tinh khiết và đơi khi để bán định lƣợng hoặc định lƣợng hoạt chất thuốc.
- Đại lƣợng đặc trƣng quan trọng về mức độ tách là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỉ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung mơi:
Trong đĩ:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mực dung mơi đo trên cùng đƣờng đi của vết, tính bằng cm.
Rf chỉ cĩ giá trị từ 0 đến 1 [8].
Khi Rf bằng 0 thì chất tan hồn tồn khơng di chuyển, cịn khi Rf bằng 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung mơi.
- Cĩ nhiểu yếu tố ảnh hƣởng đến Rf nhƣng quan trọng là: +Chất lƣợng và hoạt tính chất hấp phụ (loại bản mỏng). +Bề dày của lớp mỏng.
+Chất lƣợng và độ tinh khiết của pha động.
+Lƣợng mẫu chấm lên bản nhiều hay ít cũng làm vị trí của vết trên bản thay đổi.
b. Lựa chọn dung mơi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung mơi hay hệ dung mơi chạy cột sắc kí silicagel dựa vào sắc kí bản mỏng với các bƣớc sau:
- Hịa tan một lƣợng nhỏ cao chiết trong dung mơi Chloroform.
- Chuẩn bị một số bản mỏng rồi dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu lên trên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
- Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với các dung mơi và hệ dung mơi cĩ độ phân cực khác nhau nhƣ: Chloroform, Acetone, Diethyl eter, Ethyl acetace, Acid acetic, Chloroform/ Ethyl acetace, Acetone/ Ethyl acetace,...với các tỉ lệ khác nhau (khi thử với hệ dung mơi).
- Hiện hình dƣới đèn UV. Bản mỏng nào cĩ sự tách vết rõ rệt, các vết nằm trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài bản mỏng thì dung mơi hay hệ dung mơi tƣơng ƣng đĩ thích hợp để chạy cột sắc kí.
2.3.5. Kĩ thuật sắc kí cột
a. Nguyên tắc
- Nguyên lí tách: một mẫu thử đƣợc nạp lên một cột chứa chất hấp phụ. Cột chứa chất hấp phụ này đĩng vai trị là một pha tĩnh. Một dung mơi triển khai (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này cĩ độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung mơi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo ra các dải riêng biệt cĩ vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau , làm cơ sở cho việc phân tích [8].
b. Lựa chọn chất hấp phụ và dung mơi chạy cột sắc kí
- Thơng thƣờng sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngồi ra cịn dùng Sephadex, các chất hấp phụ khơng cĩ khả năng trƣơng nở nhƣ Al2O3, CaCO3.
- Đặc điểm của silicagel:
+ Silicagel làm pha tĩnh trong sắc kí đƣợc chế tạo bằng cách thủy giải Natrisilicat (cho tác dụng với acid sunfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngƣng tụ và polymer hĩa để đạt các chỉ tiêu vật lí cần thiết nhƣ cĩ các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lốc rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt...nhƣ yêu cầu.
c. Cách nạp silicagel vào cột
Cột đƣợc rửa sach, tráng nƣớc cất và sấy khơ, gắn trên một giá đỡ vững chắc. Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silicagel đƣợc nạp vào cột theo hai cách:
Nạp silicagel ở dạng sệt
- Cố định cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra của cột khơng cĩ lớp thủy tinh xốp thì ta cho một lớp bơng mỏng vào đáy để ngăn khơng cho silicagel chảy xuống bình hứng.
- Cho dung mơi chạy cột vào bình đựng (cốc, chai). Cân lƣợng silicagel cần thiết (đã tính tốn xác đinh ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, khuấy đều. Lƣu ý khơng đƣợc thực hiện ngƣợc lại, nghĩa là rĩt dung mơi vào silicagel bởi vì silicagel gặp dung mơi sẽ phát nhiệt, cĩ thể làm vĩn cục, khơng đồng nhất.
- Lƣợng dung mơi phải vừa đủ để hỗn hợp khơng đƣợc quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng khơng đƣợc quá lỏng.
- Rĩt hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc đuơi dài và mở nhẹ khĩa để dung mơi chảy xuống bình hứng (dung mơi này tiếp tục đƣợc dùng để rĩt trở lại đầu cột).
- Tiếp tục rĩt hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rĩt vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong cho dung mơi chảy đều qua cột vài ba lần để việc