6. Cấu trúc luận văn
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp trọng lƣợng [5]
a. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lƣợng khơng đổi.
Cách tiến hành:
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Ta chỉ chọn những lá già vừa phải, khơng quá non, cĩ màu xanh thẫm. Ta khơng thể chọn lá quá già hoặc quá non vì nhƣ thế trong lá sẽ cĩ ít hoặc nhiều nƣớc nên kết quả khơng chính xác.
Sau khi chọn đƣợc lá ta cắt bỏ cuống lá và tiến hành làm sạch và hong khơ nhƣ đã trình bày ở trên.
Cân khoảng 10g lá Rẻ quạt tƣơi cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khơ và biết khối lƣợng chính xác, sau đĩ cho vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 800C trong 3giờ. Sau khi sấy ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đĩ cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là khơng đổi hay cĩ sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.
Cơng thức tính độ ẩm như sau:
( ) (%)
∑ (%)
Trong đĩ:
m0 là khối lượng chén sứ (g); m1 là khối lượng bột dược liệu (g);
m2 là khối lượng chén sứ và bột dược liệu sau khi sấy (g).
b. Xác định hàm lượng tro của kim loại
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc tro hĩa hồn tồn mẫu bằng cách nung mẫu trong lị nung ở nhiệt độ 4500C-5000C trong khoảng 6h. Để xác định hàm lƣợng tro và các nguyên tố vơ cơ trong cơ thể động, thực vật ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp tro hĩa mẫu. Tro chính là khối lƣợng chất vơ cơ khĩ bay hơi cịn lại sau khi nung cháy hồn tồn bột dƣợc liệu.
Cách tiến hành
- Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lị nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
- Mẫu đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục sử dụng để tro hĩa. Tiến hành than hĩa mẫu trên bếp điện đến khi mẫu chuyển thành than đen thì ngừng. Sau đĩ đƣa vào tủ nung, mẫu đƣợc nung ở nhiệt độ 450 - 5000
C, trong khoảng thời gian 4 – 5 giờ. Trong quá trình nung, nếu thấy một ít than đen chƣa hĩa thành tro thì ta để nguội mẫu, rồi tia vào một ít nƣớc cất để quá trình tro hĩa diễn ra nhanh hơn. Quá trình tro hĩa kết thúc khi ta thu đƣợc tro màu trắng ngà.
- Sau khi tro hĩa xong, làm nguội mẫu trong bình hút ẩm, sau đĩ cân ngay, ta đƣợc m3.
hàm lƣợng tro của nguyên liệu.
Cơng thức tính hàm lƣợng tro nhƣ sau: % Tro = x 100% ∑ Trong đĩ: m0 là khối lƣợng chén sứ (g); m1 là khối lƣợng bột dƣợc liệu (g)
m3 là khối lƣợng chén sứ và bột dƣợc liệu sau khi hĩa tro (g)
c.Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Lấy 1gam mẫu cho vào chén sứ thêm vào 2,5ml HNO3 đậm đặc, ngâm trong vịng 24 giờ. Lấy ra đem đun cách thủy đến khi mẫu khơ và chuyển sang màu trắng, nếu mẫu khơ nhƣng chƣa cĩ màu trắng ta thêm 3 – 5ml nƣớc cất vào và tiếp tục đun cách thủy cho đến khi khơ và xuất hiện màu trắng. Để nguội chén sứ, đem định mức thành 50ml bằng nƣớc cất, tiến hành đo quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS tại “Trung tâm đo lƣờng chất lƣợng số 2, Ngơ Quyền” để xác định hàm lƣợng 5 kim loại: Cu, Pb, Zn, Hg, As.
Cơng thức chuyển đổi từ hàm lƣợng mg/l sang hàm lƣợng mg/kg nhƣ sau:
(mg/l) (mg/kg) 0 C C 100 m
Trong đĩ, m0 : khối lƣợng mẫu thân lá cây Rẻ quạt trƣớc khi tro hĩa.
2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết tách
a. Khảo sát thời gian chiết tốt nhất đối với bột lá cây Rẻ quạt
Yếu tố thời gian: hiệu suất của quá trình chiết các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung mơi cịn phụ thuộc vào thời gian, thơng thƣờng hiệu suất chiết tăng
m3 − mo m1
theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại. Cơ quay chân khơng dung mơi của các dịch chiết thu đƣợc cặn ở các thời gian chiết khác nhau, đem cân. Chọn thời gian chiết hiệu quả nhất.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị bộ chiết Soxhlet 250ml, rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất, sấy khơ. - Cân một lƣợng khoảng m0 gam các mẫu nguyên liệu lá cây Rẻ quạt, sau đĩ cho một lƣợng dung mơi xác định 150 ml của cùng một dung mơi. Tiến hành chiết bằng phƣơng pháp chiết soxhlet với nhiệt độ nhƣ nhau, tùy thuộc vào từng dung mơi trong khoảng thời gian khác nhau: 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ,10 giờ, 12 giờ.
- Sau thời gian chiết ta lấy V dịch chiết =120 ml. Sau đĩ đem cơ cạn dịch chiết bằng máy cơ quay chân khơng. Cơ cạn dịch chiết đến 20 ml. Cho dịch chiết thu đƣợc vào cốc 50 ml đã rửa sạch, sấy khơ, làm nguội. Cân khối lƣợng dịch chiết thu đƣợc (m1). Cho vào cốc 20 ml dung mơi sau đĩ đem cân (m2).
Phần trăm khối lƣợng chất chiết ra đƣợc tính theo cơng thức:
−
2.4.3. Chiết tách Tetradecanoic Acid bằng phƣơng pháp chƣng ninh [10] ninh [10]
- Cân khoảng 75 gam bột mịn lá cây Rẻ quạt cho vào bình cầu cĩ dung tích 500ml (khối lƣợng bột cho vào khoảng 1/3 thể tích bình cầu), lắp vào giá đỡ.
- Dùng ống đong lấy khoảng 350ml dung mơi ethyl acetate cho vào bình cầu chứa bột nguyên liệu trên (thể tích dung mơi khơng quá 2/3 thể tích bình).
- Lắp ống sinh hàn rồi tiến hành gia nhiệt đun hồi lƣu trong 12 giờ bằng bếp cách thủy ở nhiệt độ 700C.
- Tiến hành các bƣớc nhƣ trên với ba bộ chƣng ninh tiếp theo.
Hình 2.8. Bộ dụng cụ chiết bằng phương pháp chưng ninh
a. Lọc dịch chiết
- Sau khi chƣng ninh đủ 12 giờ, lấy tồn bộ ra khỏi bếp cách thủy, để yên về nhiệt độ phịng, dung mơi cĩ màu ở phía trên, bột nguyên liệu ở dƣới bình cầu.
- Đổ (gạn) phần dung mơi ở phía trên sang một bình cầu khác cĩ đậy nắp (giảm bớt khả năng bay hơi của dung mơi). Phần dung mơi ở trong bình tam giác cĩ đậy nắp, phần chất rắn (bột nguyên liệu) cịn lại trong bình cầu.
- Tiến hành đồng thời lọc phần dịch lọc và lọc phần chất rắn để thu dịch chiết. Chú ý, lọc phần chất rắn phải rửa lại bằng dung mơi ethyl acetate, mỗi lần rửa khoảng 5-10ml cho đến khi dịch ethyl acetate chảy xuống khơng cịn màu.
- Đổ dồn các dịch lọc lại rồi tiến hành cơ đuổi dung mơi. Dịch lọc ethyl acetate thu đƣợc đƣợc thể hiện ở hình 2.9.
Hình 2.9. Lọc thu lấy dịch chiết ethyl acetate
b. Bay hơi dung mơi dịch chiết để thu cao chiết ethyl acetate. Thực hiện bằng phương pháp chưng cất đơn
- Cho dịch chiết vào bình cầu cĩ dung tích 250ml sao cho thể tích dịch chiết chƣa đến 2/3 thể tích bình rồi lắp vào giá đỡ.
- Tiến hành lắp bộ dụng cụ nhƣ hình 2.10.
- Đun trên bếp cách thủy để cơ đuổi hết dung mơi cho đến khi nào thu đƣợc hỗn hợp sền sệt và khơng cịn nhỏ giọt từ ống sừng bị thì dừng. Chú ý đuổi cho thật kiệt dung mơi nhƣng khơng đƣợc cháy. Sau khi cơ đuổi hết dung mơi thu đƣợc cao ethyl acetate cĩ mùi thơm, màu nâu đậm.
Hình 2.10. Cơ đuổi dung mơi bằng phương pháp chưng cất đơn thu cao chiết
2.4.4. Phân lập cấu tử tinh khiết
a. Tiến hành lựa chọn dung mơi kết tinh ở nhiệt độ sơi
- Tiến hành trích một lƣợng cao chiết nhƣ nhau 10-50mg cho vào 4 ống nghiệm; lấy 1ml lần lƣợt các dung mơi diethyl eter, acetone, ethyl acetace, chloroform cho vào từng ống nghiệm. Đun các ống nghiệm trên bếp cách thủy với nhiệt độ sơi của từng dung mơi và quan sát hiện tƣợng. Đối với các chất rắn trong các ống nghiệm chƣa tan hồn tồn, tiến hành nhỏ thêm từ từ từng giọt dung mơi tƣơng ứng vào và tiếp tục đun trên bến cách thủy, quan sát hiện tƣợng, thu đƣợc kết quả ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Khảo sát tính tan của chất rắn ở các dung mơi
Dung mơi diethyl eter acetone ethyl acetace chloroform
Tính tan - + - ++
Ghi chú: (++) tan tốt (+) tan (-) khơng tan - Nhận xét: Ở nhiệt độ sơi của 4 dung mơi diethyl eter, acetone, ethyl acetace, chloroform thì chất rắn tan tốt trong dung mơi chloroform.
Vậy, sau khi tiến hành khảo sát sự hịa tan của một chất với dung mơi, chọn dung mơi chloroform để thực hiện kết tinh lại.
b. Các thao tác khi kết tinh
Chuẩn bị dung dịch kết tinh hay dung dịch nƣớc cái:
- Cho lƣợng chất cần kết tinh (lƣợng cao chiết thu đƣợc) vào bình cầu 250 ml.
- Cho vào bình cầu trên một lƣợng thể tích dung mơi kết tinh Chloroform sao cho với thể tích đĩ chƣa đủ làm tan chất rắn trong bình cầu.
- Lắp ống sinh hàn thẳng vào và đun sơi hỗn hợp. Quan sát sự tan của chất rắn.
+ Nếu chƣa đun tới nhiệt độ sơi (nghĩa là dung mơi chƣa sơi) mà chất rắn đã tan hết thì lƣợng dung mơi kết tinh dƣ. Do vậy cần cho một lƣợng chất
rắn nữa vào bình cầu và tiếp tục đun sơi.
+ Nếu ở nhiệt độ sơi mà thấy chất rắn chƣa hồn tồn tan hết thì cho thêm từ từ một ít dung mơi vào: dùng phễu rĩt nhẹ vào ống sinh hàn thẳng dung mơi từ từ chảy xuống và quan sát sự tan.
+ Nếu tiếp tục thêm dung mơi vào nhƣng chất rắn vẫn khơng tan thì đĩ khơng phải là chất rắn cần kết tinh.
- Đun nĩng trong dung mơi kết tinh, gạn dịch lọc qua bình tam giác cĩ đậy nắp, tiếp tục làm nhƣ vậy cho đến khi dung mơi chloroform cho vào trong bình cầu trắng cầu trắng trong thì dừng.
Hình 2.11. Bộ dụng cụ kết tinh lại
- Cuối cùng thu đƣợc 2 phần: phần 1 là phần dịch lọc đƣợc gạn ra trong quá trình hịa tan nĩng và phần 2 là phần rắn trong bình cầu.
- Phần 1 là dịch lọc, đem lọc và cơ đuổi bay hơi hết dung mơi thu đƣợc cao sệt. Dùng cao chiết này để chạy sắc kí.
- Phần 2 tiếp tục chƣng ninh với dung mơi chlorofrom.
Lọc nĩng dung dịch:
- Phần 2 sau khi đem chƣng ninh với chloroform, lọc dung dịch đang nĩng để loại bỏ chất bẩn, chất phụ khơng tan ra khỏi dung dịch. Cần lọc nhanh để tránh chất kết tinh ở trên phễu.
Thực hiện kết tinh chất và gạn lấy tinh thể:
- Dung dịch nƣớc cái (phần dịch lọc thu đƣợc sau khi lọc nĩng) đƣợc đậy miệng, để nguội rồi làm lạnh bằng cách bỏ vào tủ lạnh trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ lấy dịch lọc ra, thì thấy chất rắn kết tinh, tiến hành tách lọc tinh thể bằng cách lọc qua giấy lọc thể hiện ở hình 2.12, sau đĩ để khơ tự nhiên 1-2 giờ, tiếp đĩ cho vào bình hút ẩm trong vài ngày trƣớc khi đem xác định điểm chảy.
Hình 2.12. Tinh thể tạo thành sau khi làm lạnh, lọc lấy tinh thể
Làm khơ tinh thể và xác định điểm chảy
- Làm khơ trong tủ sấy thƣờng ở nhiệt độ khoảng 500C.
- Xác định điểm chảy của tinh thể thu đƣợc bằng dụng cụ đo nhiệt độ nĩng chảy cĩ lắp kính hiển vi thì ở nhiệt độ 2900C tinh thể bắt đầu chuyển sang màu đen.
- Nhƣ vậy, ở điểm chảy là 2900
C quá cao so với điểm chảy lí thuyết của Tetradecanoic acid, chứng tỏ sản phẩm thu đƣợc chƣa tinh khiết, vì thế tơi tiếp tục tiến hành tinh chế bằng sắc kí cột.
Trong luận văn này, tơi phân tích SKBM sử dụng:
- Sắc kí bản mỏng Silicgel 60 F254 hãng Merck, dày 0,2mn tráng trên nền nhơm.
- Hiện vết bằng đèn UV (BIOBLOCK).
- Silicagel nhồi cột là silicagel Merck cĩ kích thƣớc hạt 0,04-0,06mm. - Cột sắc kí là ống thủy tinh hình trụ cĩ kích thƣớc đƣờng kính cột bằng 2cm, chiều cao cột 50cm, bên dƣới cĩ van khĩa.
- Tiến hành chạy sắc kí cột với tinh thể kết tinh màu trắng (TT)
Đem lƣợng tinh thể màu trắng thu đƣợc hịa tan hồn tồn vào dung mơi chloroform trong bình cầu, sau khi chấm bản mỏng để tìm dung mơi thích hợp để chạy cột ta thêm silicagel (khoảng 3 gam) vào lắc đều để chất đƣợc gắn đều trên silicagel. Sau đĩ hỗn hợp này đƣợc đem đi cơ quay bằng máy quay cất chân khơng ở áp suất giảm, nhiệt độ 700C để làm bay hơi dung mơi đến khơ hồn tồn, lƣợng chất đã đƣợc gắn silicagel đƣợc đổ ra khỏi bình cầu. Sau đĩ dùng cối nghiền, nghiền tan các cục vĩn tạo thành bột khơ mịn sau đĩ dùng phễu rĩt từ từ hỗn hợp chất vào cột sắc kí. Làm nhƣ vậy với cao chiết chloroform, lấy khoảng 8g silicagel.
Chuẩn bị cột sắc kí:
- Cho dung mơi chloroform vào cốc thủy tinh (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
- Lƣợng silicagel lấy khoảng 100g cho vào cốc thủy tinh trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
- Cho một miếng bơng nhỏ vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Hình 2.13. Cột sau khi được nhồi ở dạng sệt
Nạp mẫu vào cột
- Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp khơ.
Hình 2.14. Nạp mẫu vào cột bằng phương pháp khơ
Sau khi cho dung mơi Chlorofrom vào đầy cột, tiến hành bắt đầu giải li. Chất đi ra khỏi cột đƣợc hứng bằng các lọ penicilin đã đánh số thứ tự tăng dần. Tốc độ chảy đƣợc điều chỉnh khoảng 2 giây/ giọt
cao chiết chloroform thu đƣợc các phân đoạn. Cơ quay chân khơng các phân đoạn giống nhau thu đƣợc cao chất. Tiếp tục xác định cấu trúc bằng các phƣơng pháp phổ.
Hình 2.15.Giải li sắc kí cột và hứng thu các phân đoạn
Sơ đồ nghiên cứu xác định thành phần hĩa học trong dịch chiết lá cây Rẻ quạt hình 2.16.
Hình 2.16. Sơ đồ nghiên cứu xác định thành phần hĩa học trong dịch chiết lá cây Rẻ quạt Xử lý sơ bộ: làm sạch, phơi khơ, nghiền mịn -Xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro -Xác định hàm lƣợng kim loại nặng Bột dƣợc liệu khơ Lá cây Rẻ quạt
Chiết soxhlet với dung mơi
(Khảo sát thời gian chiết tốt nhất, tỷ lệ R-L)
dichloromethane ethyl acetate
n-hexane Methanol Dịch chiết n-hexane Bã Dịch chiết dichloro methane Bã Dịch chiết ethyl acetate Bã Dịch chiết methanol Bã Đo GC-MS Đo GC-MS Đo GC-MS Đo GC-MS
Sơ đồ điều chế cao chiết ethyl acetate đƣợc trình bày trên sơ đồ hình 2.17.
Hình 2.17. Sơ đồ điều chế cao chiết ethyl acetate
Lá cây Rẻ quạt
Xử lí sơ bộ: làm sạch, phơi khơ, nghiền mịn
Bột Rẻ quạt
- Chiết chƣng ninh trong dung mơi ethyl acetate trong 10 giờ ở 770C
- Lọc
Bã Dịch chiết ethyl acetate
Chƣng cất đơn cơ đuổi dung mơi
Cao ethyl acetate
Loại béo bằng dietyl eter
Đo t0 nc
-Kiểm tra phân đoạn bằng SKBM -Cơ quay chân khơng
Cao Chloroform (6g) Cơ đuổi dung mơi
-Khảo sát lựa chọn dung mơi giải li
bằng SKBM
-Chạy SKC phân Thu đƣợc các phân đoạn chất -Kiểm tra các phân đoạn
bằng SKBM
-Cơ quay chân khơng các phân đoạn giống nhau thu đƣợc
Cao ethyl acetate đã loại béo
- Khảo sát chọn dung mơi kết tinh lại
- Chuẩn bị dung dịch kết tinh trong dung mơi Chloroform
- Lọc
Cặn rắn
- Chƣng ninh với dung mơi Chloroform
- Lọc nĩng Bã Dịch lọc khơng màu Dịch lọc 1 Thực hiện kết tinh chất Tạo tinh thể Gạn lấy và làm khơ Tinh thể
-Khảo sát lựa chọn dung mơi giải li bằng SKBM - Chạy SKC để tinh chế chất Phân đoạn hợp chất TT Xác định cấu trúc bằng các pp phổ: phổ IR, phổ MS, phổ 1H-NMR, 13C-NMR Cao chất của các