CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5. Kĩ thuật sắc kí cột
a. Nguyên tắc
- Nguyên lí tách: một mẫu thử đƣợc nạp lên một cột chứa chất hấp phụ. Cột chứa chất hấp phụ này đĩng vai trị là một pha tĩnh. Một dung mơi triển khai (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này cĩ độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung mơi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo ra các dải riêng biệt cĩ vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau , làm cơ sở cho việc phân tích [8].
b. Lựa chọn chất hấp phụ và dung mơi chạy cột sắc kí
- Thơng thƣờng sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngồi ra cịn dùng Sephadex, các chất hấp phụ khơng cĩ khả năng trƣơng nở nhƣ Al2O3, CaCO3.
- Đặc điểm của silicagel:
+ Silicagel làm pha tĩnh trong sắc kí đƣợc chế tạo bằng cách thủy giải Natrisilicat (cho tác dụng với acid sunfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngƣng tụ và polymer hĩa để đạt các chỉ tiêu vật lí cần thiết nhƣ cĩ các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lốc rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt...nhƣ yêu cầu.
c. Cách nạp silicagel vào cột
Cột đƣợc rửa sach, tráng nƣớc cất và sấy khơ, gắn trên một giá đỡ vững chắc. Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silicagel đƣợc nạp vào cột theo hai cách:
Nạp silicagel ở dạng sệt
- Cố định cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra của cột khơng cĩ lớp thủy tinh xốp thì ta cho một lớp bơng mỏng vào đáy để ngăn khơng cho silicagel chảy xuống bình hứng.
- Cho dung mơi chạy cột vào bình đựng (cốc, chai). Cân lƣợng silicagel cần thiết (đã tính tốn xác đinh ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, khuấy đều. Lƣu ý khơng đƣợc thực hiện ngƣợc lại, nghĩa là rĩt dung mơi vào silicagel bởi vì silicagel gặp dung mơi sẽ phát nhiệt, cĩ thể làm vĩn cục, khơng đồng nhất.
- Lƣợng dung mơi phải vừa đủ để hỗn hợp khơng đƣợc quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng khơng đƣợc quá lỏng.
- Rĩt hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc đuơi dài và mở nhẹ khĩa để dung mơi chảy xuống bình hứng (dung mơi này tiếp tục đƣợc dùng để rĩt trở lại đầu cột).
- Tiếp tục rĩt hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rĩt vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong cho dung mơi chảy đều qua cột vài ba lần để việc nạp cột đƣợc chặt chẽ và trong cột đƣợc đồng nhất. Lƣu ý trong quá trình nạp cột, nhất thiết khơng đƣợc để cho đầu cột bị khơ, nghĩa là luơn luơn cĩ dung mơi phủ trên phần đầu cột.
- Sau khi kết thúc quá trình nạp xong, mặt thống silicagel phải phẳng. Nếu mặt thống chƣa phẳng , phải cho dung mơi thêm cao lên trên phần đầu
cột rồi dùng đũa thủy tinh khuấy đão nhẹ phần dung mơi sát mặt thống, làm xáo trộn một phần silicagel ở trên đầu cột, để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thống bằng phẳng.
- Với sắc kí cột Sephadex ta thao tác tƣơng tự nhƣng cần ngâm Sephadex với dung mơi một thời gian để Sephadex trƣơng nở trƣớc khi cho vào cột.
Nạp silicagel dạng khơ
- Cột đƣợc giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bơng nhỏ vào đáy cột (nếu cột khơng cĩ lớp thủy tinh xốp).
- Rĩt dung mơi chạy cột vào khoảng hai phần ba cột. Cho từ từ silicagel dạng khơ vào cột qua phễu lọc, vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột.
- Sau khi nạp silicagel xong, cho dung mơi chảy qua vài lần đến khi đuổi hết bọt khí trong cột để cột đƣợc ổn định trƣớc khi nạp mẫu vào.
- Thơng thƣờng ngƣời ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
e. Cách nạp mẫu vào cột
Cĩ hai phƣơng pháp nạp mẫu vào cột sắc kí sau:
Phương pháp khơ
- Nếu mẫu chất khơng tan hoặc tan kém trong dung mơi lựa chọn để bắt đầu q trình sắc kí cột, vì đây là loại dung mơi kém phân cực, thay vì phải hịa tan mẫu trong dung mơi phân cực (cĩ thể ảnh hƣởng đến quá trình giải li) cĩ thể nạp mẫu khơ.
- Hịa tan hồn tồn mẫu trong dung mơi thích hợp, cho một lƣợng silicagel vừa đủ (lƣợng silicagel cho vào càng ít càng tốt nhƣng phải đủ để cĩ thể cơ quay mẫu đƣợc khơ hồn tồn) vào rồi đem cất quay cơ đuổi dung mơi đến khơ hồn tồn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột thật mịn.
(đủ thấm ƣớt mẫu khơ cho vào). Mẫu khơ đã đƣợc làm tơi mịn đƣợc cho vào cột sắc kí từ từ thơng qua phễu sau khi đã khố cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phƣơng pháp khơ thì lƣợng dung mơi phải vừa đủ, khơng nhiều quá; lƣợng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ƣớt đều dung mơi, khơng cĩ bọt khí. Cho một lớp silicagel vào đầu cột để bảo vệ bề mặt. Cuối cùng, cho dung mơi giải li vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly[2].
Phương pháp ướt
- Thƣờng áp dụng khi mẫu tan hồn tồn trong dung mơi chạy cột ban đầu.
- Lƣợng dung mơi dùng hồ tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột. Cĩ thể áp dụng tính tốn cụ thể nhƣ sau: thể tích dung mơi cần lấy để hồ tan mẫu = 0,4.d2 ml, với d là đƣờng kính trong của cột tính bằng mm.
- Mẫu đƣợc cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột.
- Với phƣơng pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung mơi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khố cột. Sau đĩ, mở khố để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lƣợng nhỏ dung mơi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống đồng đều) [8].
2.3.6. Các phương pháp xác định cấu trúc hĩa học của một hợp chất
a. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)[9]
- Phổ hồng ngoại đƣợc sử dụng rộng rãi trong những kĩ thuật phân tích rất hiệu quả và một trong những ƣu điểm quan trọng nhất của phƣơng pháp này là cung cấp thơng tin về cấu trúc phân tử nhanh, khơng địi hỏi các phƣơng pháp tính tốn phức tạp. Kĩ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là
các hợp chất hĩa học cĩ khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của hợp chất hĩa học dao động với các vận tốc dao động khác nhau và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là quang phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại.
- Các đám phổ khác nhau cĩ mặt trong phổ hồng ngoại tƣơng ứng với các nhĩm chức đặc trƣng và các liên kết cĩ trong phân tử của hợp chất. Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất đƣợc xem nhƣ là “dấu vân tay”, dựa vào đĩ ta cĩ thể nhận dạng đƣợc chúng. Nhƣ vậy phƣơng pháp phân tích phổ hồng ngoại cung cấp những thơng tin quan trọng về các dao động của các phân tử, do đĩ là thơng tin về cấu trúc của phân tử.
- Các vùng phổ hồng ngoại thƣờng đƣợc ghi với trục tung biểu diễn T% (độ truyền qua), trục hồnh biểu diễn số sĩng với giá trị giảm dần. Theo thĩi quen ngƣời ta vẫn gọi số sĩng là tần số và kí hiệu là v (cm-1
).
- Hầu hết các nhĩm nguyên tử trong hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000-650 cm-1. Vùng phổ từ 4000 –1500 cm-1 đƣợc gọi là vùng nhĩm chức vì chứa hầu hết các vân hấp thụ của các nhĩm nhƣ OH, NH, C=O, C=C… Vùng phổ nhĩm chức tập trung làm 3 vùng mà mỗi vùng tần số đặc trƣng của mỗi nhĩm cĩ giá trị thay đổi phụ thuộc vào cấu tạo của phân tử.
+ Vùng 3650 – 2400 cm-1: chứa các vân dao động hĩa trị của X-H (X: O, N, S, P…).
+ Vùng 2400 – 1900 cm-1: chứa các vân dao động hĩa trị của các nhĩm mang liên kết ba hoặc hai liên kết đơi kề nhau.
+ Vùng 1900 – 1500 cm-1: chứa các vân dao động hĩa trị của các nhĩm mang liên kết đơi và dao động biến dạng của liên kết –NH2.
- Vùng phổ tử 1500 – 700 cm-1 mặc dù cĩ chứa các vân hấp thụ đặc trƣng cho dao động hĩa trị của các liên kết đơn nhƣ C-C, C-O, C-N… và các vân do dao động biến dạng của các liên kết nhƣ C-C, C-H… nhƣng thƣờng
đƣợc dùng để nhận dạng tồn phân tử hơn là xác định nhĩm chức. Do đĩ vùng phổ này thƣờng đƣợc gọi là vùng vân tay.
- Vùng phổ từ 650 – 250 cm-1 cung cấp các thơng tin cĩ giá trị đối với các hợp chất vơ cơ và phức chất, vì chứa các vân phổ cĩ liên quan đến dao động hĩa trị của liên kết C-Br, C-I và C-M (M là kim loại).
b. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [9]
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp vật lí hiện đại nghiên cứu cấu tạo các hợp chất hữu cơ, cĩ ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các phân tử phức tạp nhƣ các hợp chất thiên nhiên. Phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử dụng là NMR-1H và phổ NMR-13C.
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc xây dựng trên nguyên tắc spin hạt nhân (trong nguyên tử, hạt nhân tự quay quanh trục cĩ momen động lƣợng riêng là spin hạt nhân) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngồi thì cĩ thể chia thành hai mức năng lƣợng. NMR hoạt hĩa spin hạt nhân khi nguyên tố cĩ số proton hoặc nơtron lẻ. Nhƣ thế 1H cho ta tín hiệu cộng hƣởng từ hạt nhân, đây là proton đƣợc sử dụng nhiều nhất vì 1
Hchiếm tỉ lệ gần 100% trong tự nhiên và phổ 1H nhạy hơn. Các hạt nhân của 13C, 2H, 19F cũng cho tín hiệu NMR tuy nhiên các đồng vị này ít tồn tại trong tự nhiên nên ít nhạy và ít đƣợc sử dụng hơn. Quang phổ NMR cĩ thể đƣợc thực hiện trên nguyên tắc tìm điều kiện cộng hƣởng (hoặc trong một từ trƣờng ngồi cố định hoặc trong một tần số cố định).
Trong một phân tử, một hạt nhân đƣợc bao bọc bởi các điện tử và các hạt nhân cĩ từ tính lân cận khác. Do đĩ tác dụng thực của từ trƣờng ngồi vào hạt nhân nghiên cứu khơng hồn tồn giống với từng hạt nhân độc lập. Khi đĩ cĩ hai yếu tố ảnh hƣởng đến tác dụng của từ trƣờng ngồi lên hạt nhân nghiên cứu đĩ là sự che chắn của đám mây điện tử xung quanh hạt nhân và ảnh hƣởng của những hạt nhân bên cạnh cĩ trong phân tử. Trong một phân tử, tùy
theo cấu trúc mà tần số cộng hƣởng của proton (hay 13C) khác nhau. Tổng số các mũi cộng hƣởng đĩ tạo thành phổ NMR của phân tử. Mỗi phân tử cĩ cấu trúc khác nhau nên sẽ cĩ phổ NMR đặc trƣng khác nhau. Hai yếu tố quan trọng trong phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là vị trí mũi (cho biết độ dịch chuyển hĩa học) và hình dạng mũi (cho biết tƣơng tác của hạt nhân đang xét với hạt nhân kế cận). Vị trí mũi và hình dạng mũi cho biết cấu trúc của phân tử đang xét.
c. Phương pháp khối phổ (MS) [9]
- Phƣơng pháp khối phổ là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lƣợng phân tử chất đĩ. Chất nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ kế. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà ngƣời ta phân biệt máy khối phổ ion dƣơng hay âm. Loại máy khối phổ làm việc với ion dƣơng cho nhiều thơng tin hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.
- Phƣơng pháp phổ khối lƣợng cĩ ý nghĩa quan trọng đối với việc nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Dựa trên các số khối thu đƣợc trên phổ cĩ thể xây dựng cấu trúc phân tử hoặc chứng minh sự đúng đắn của cơng thức cấu tạo dự kiến.
- Quá trình ion hĩa phân tử
+ Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lƣợng rất bé chất thử (từ microgam đến miligam), phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dƣơng.
+ Các mảnh ion này nhờ bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cƣờng độ khác nhau tƣơng ứng với lƣợng khối của mỗi ion.
+ Cĩ nhiều loại máy khối phổ với mức độ phân giải (resolution) khác nhau.
+ Máy cĩ độ phân giải cao là máy cĩ khả năng tách đƣợc hai mảnh ion cĩ khối lƣợng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối (m/e).
+ Loại máy cĩ độ phân giải trên 10.000 là loại máy khối phổ trình độ phân giải cao. Loại máy cĩ mức phân giải thấp nhất cũng cĩ thể tách đƣợc các ion chênh nhau một đơn vị khối đối với các ion cĩ số khối dƣới 500m/e.
- Nguyên lí cấu tạo khối phổ kế, gồm 4 bộ phận chính:
+ Hĩa khí mẫu (cịn gọi là bộ phận nhận và xử lý chất thử): các chất
rắn hay lỏng đƣợc đƣa vào buồng mẫu cĩ áp suất giảm 10-6 mmHg và nhiệt độ đốt nĩng cĩ thể lên đến 2000C. Dƣới điều kiện này thì hầu hết các chất lỏng và rắn đều biến thành thể hơi. Lƣợng mẫu cần 0,1-1mg.
+ Buồng ion hĩa: dẫn dịng phân tử khí qua một dịng electron cĩ
hƣớng vuơng gĩc với nĩ để ion hĩa mẫu rồi đi qua điện trƣờng U để tăng tốc. + Tách các ion theo số khối(cịn gọi là bộ phận phân tích từ): các ion
hình thành cĩ số khối m/e đƣợc phân tách ra khỏi nhau bằng các thiết bị khác nhau nhƣ thiết bị phân tách hội tụ đơn, thiết bị phân tách hội tụ kép, thiết bị phân tách ion tứ cực.
+ Nhận biết các ion bằng detecto (cịn gọi là bộ phận tập hợp ion và
phĩng đại):các ion đi ra từ bộ phận tách cĩ cƣờng độ nhỏ nên cần khuyếch
đại để phát hiện. Một trong những thiết bị này là máy nhân electron.
+ Bộ phận ghi nhận tín hiệu: các tín hiệu từ bộ khuyếch đại truyền ra
đƣợc nạp vào bộ nhớ máy tính và xử lí kết quả rồi in ra phổ. - Ứng dụng
+ Xác định các hợp chất chƣa biết bằng cách dựa vào khối lƣợng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nĩ.
+ Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất. + Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần riêng của nĩ.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Phƣơng pháp trọng lƣợng [5] 2.4.1. Phƣơng pháp trọng lƣợng [5]
a. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lƣợng khơng đổi. Cách tiến hành:
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm,
cân phân tích.
Ta chỉ chọn những lá già vừa phải, khơng quá non, cĩ màu xanh thẫm. Ta khơng thể chọn lá quá già hoặc quá non vì nhƣ thế trong lá sẽ cĩ ít hoặc nhiều nƣớc nên kết quả khơng chính xác.
Sau khi chọn đƣợc lá ta cắt bỏ cuống lá và tiến hành làm sạch và hong khơ nhƣ đã trình bày ở trên.
Cân khoảng 10g lá Rẻ quạt tƣơi cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khơ và biết khối lƣợng chính xác, sau đĩ cho vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 800C trong 3giờ. Sau khi sấy ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đĩ cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là khơng đổi hay cĩ sai số khoảng 0,005g thì dừng quá