CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.4. Phân lập cấu tử tinh khiết
a. Tiến hành lựa chọn dung mơi kết tinh ở nhiệt độ sơi
- Tiến hành trích một lƣợng cao chiết nhƣ nhau 10-50mg cho vào 4 ống nghiệm; lấy 1ml lần lƣợt các dung mơi diethyl eter, acetone, ethyl acetace, chloroform cho vào từng ống nghiệm. Đun các ống nghiệm trên bếp cách thủy với nhiệt độ sơi của từng dung mơi và quan sát hiện tƣợng. Đối với các chất rắn trong các ống nghiệm chƣa tan hồn tồn, tiến hành nhỏ thêm từ từ từng giọt dung mơi tƣơng ứng vào và tiếp tục đun trên bến cách thủy, quan sát hiện tƣợng, thu đƣợc kết quả ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Khảo sát tính tan của chất rắn ở các dung mơi
Dung mơi diethyl eter acetone ethyl acetace chloroform
Tính tan - + - ++
Ghi chú: (++) tan tốt (+) tan (-) khơng tan - Nhận xét: Ở nhiệt độ sơi của 4 dung mơi diethyl eter, acetone, ethyl acetace, chloroform thì chất rắn tan tốt trong dung mơi chloroform.
Vậy, sau khi tiến hành khảo sát sự hịa tan của một chất với dung mơi, chọn dung mơi chloroform để thực hiện kết tinh lại.
b. Các thao tác khi kết tinh
Chuẩn bị dung dịch kết tinh hay dung dịch nƣớc cái:
- Cho lƣợng chất cần kết tinh (lƣợng cao chiết thu đƣợc) vào bình cầu 250 ml.
- Cho vào bình cầu trên một lƣợng thể tích dung mơi kết tinh Chloroform sao cho với thể tích đĩ chƣa đủ làm tan chất rắn trong bình cầu.
- Lắp ống sinh hàn thẳng vào và đun sơi hỗn hợp. Quan sát sự tan của chất rắn.
+ Nếu chƣa đun tới nhiệt độ sơi (nghĩa là dung mơi chƣa sơi) mà chất rắn đã tan hết thì lƣợng dung mơi kết tinh dƣ. Do vậy cần cho một lƣợng chất
rắn nữa vào bình cầu và tiếp tục đun sơi.
+ Nếu ở nhiệt độ sơi mà thấy chất rắn chƣa hồn tồn tan hết thì cho thêm từ từ một ít dung mơi vào: dùng phễu rĩt nhẹ vào ống sinh hàn thẳng dung mơi từ từ chảy xuống và quan sát sự tan.
+ Nếu tiếp tục thêm dung mơi vào nhƣng chất rắn vẫn khơng tan thì đĩ khơng phải là chất rắn cần kết tinh.
- Đun nĩng trong dung mơi kết tinh, gạn dịch lọc qua bình tam giác cĩ đậy nắp, tiếp tục làm nhƣ vậy cho đến khi dung mơi chloroform cho vào trong bình cầu trắng cầu trắng trong thì dừng.
Hình 2.11. Bộ dụng cụ kết tinh lại
- Cuối cùng thu đƣợc 2 phần: phần 1 là phần dịch lọc đƣợc gạn ra trong quá trình hịa tan nĩng và phần 2 là phần rắn trong bình cầu.
- Phần 1 là dịch lọc, đem lọc và cơ đuổi bay hơi hết dung mơi thu đƣợc cao sệt. Dùng cao chiết này để chạy sắc kí.
- Phần 2 tiếp tục chƣng ninh với dung mơi chlorofrom.
Lọc nĩng dung dịch:
- Phần 2 sau khi đem chƣng ninh với chloroform, lọc dung dịch đang nĩng để loại bỏ chất bẩn, chất phụ khơng tan ra khỏi dung dịch. Cần lọc nhanh để tránh chất kết tinh ở trên phễu.
Thực hiện kết tinh chất và gạn lấy tinh thể:
- Dung dịch nƣớc cái (phần dịch lọc thu đƣợc sau khi lọc nĩng) đƣợc đậy miệng, để nguội rồi làm lạnh bằng cách bỏ vào tủ lạnh trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ lấy dịch lọc ra, thì thấy chất rắn kết tinh, tiến hành tách lọc tinh thể bằng cách lọc qua giấy lọc thể hiện ở hình 2.12, sau đĩ để khơ tự nhiên 1-2 giờ, tiếp đĩ cho vào bình hút ẩm trong vài ngày trƣớc khi đem xác định điểm chảy.
Hình 2.12. Tinh thể tạo thành sau khi làm lạnh, lọc lấy tinh thể
Làm khơ tinh thể và xác định điểm chảy
- Làm khơ trong tủ sấy thƣờng ở nhiệt độ khoảng 500C.
- Xác định điểm chảy của tinh thể thu đƣợc bằng dụng cụ đo nhiệt độ nĩng chảy cĩ lắp kính hiển vi thì ở nhiệt độ 2900C tinh thể bắt đầu chuyển sang màu đen.
- Nhƣ vậy, ở điểm chảy là 2900
C quá cao so với điểm chảy lí thuyết của Tetradecanoic acid, chứng tỏ sản phẩm thu đƣợc chƣa tinh khiết, vì thế tơi tiếp tục tiến hành tinh chế bằng sắc kí cột.
Trong luận văn này, tơi phân tích SKBM sử dụng:
- Sắc kí bản mỏng Silicgel 60 F254 hãng Merck, dày 0,2mn tráng trên nền nhơm.
- Hiện vết bằng đèn UV (BIOBLOCK).
- Silicagel nhồi cột là silicagel Merck cĩ kích thƣớc hạt 0,04-0,06mm. - Cột sắc kí là ống thủy tinh hình trụ cĩ kích thƣớc đƣờng kính cột bằng 2cm, chiều cao cột 50cm, bên dƣới cĩ van khĩa.
- Tiến hành chạy sắc kí cột với tinh thể kết tinh màu trắng (TT)
Đem lƣợng tinh thể màu trắng thu đƣợc hịa tan hồn tồn vào dung mơi chloroform trong bình cầu, sau khi chấm bản mỏng để tìm dung mơi thích hợp để chạy cột ta thêm silicagel (khoảng 3 gam) vào lắc đều để chất đƣợc gắn đều trên silicagel. Sau đĩ hỗn hợp này đƣợc đem đi cơ quay bằng máy quay cất chân khơng ở áp suất giảm, nhiệt độ 700C để làm bay hơi dung mơi đến khơ hồn tồn, lƣợng chất đã đƣợc gắn silicagel đƣợc đổ ra khỏi bình cầu. Sau đĩ dùng cối nghiền, nghiền tan các cục vĩn tạo thành bột khơ mịn sau đĩ dùng phễu rĩt từ từ hỗn hợp chất vào cột sắc kí. Làm nhƣ vậy với cao chiết chloroform, lấy khoảng 8g silicagel.
Chuẩn bị cột sắc kí:
- Cho dung mơi chloroform vào cốc thủy tinh (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
- Lƣợng silicagel lấy khoảng 100g cho vào cốc thủy tinh trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
- Cho một miếng bơng nhỏ vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Hình 2.13. Cột sau khi được nhồi ở dạng sệt
Nạp mẫu vào cột
- Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp khơ.
Hình 2.14. Nạp mẫu vào cột bằng phương pháp khơ
Sau khi cho dung mơi Chlorofrom vào đầy cột, tiến hành bắt đầu giải li. Chất đi ra khỏi cột đƣợc hứng bằng các lọ penicilin đã đánh số thứ tự tăng dần. Tốc độ chảy đƣợc điều chỉnh khoảng 2 giây/ giọt
cao chiết chloroform thu đƣợc các phân đoạn. Cơ quay chân khơng các phân đoạn giống nhau thu đƣợc cao chất. Tiếp tục xác định cấu trúc bằng các phƣơng pháp phổ.
Hình 2.15.Giải li sắc kí cột và hứng thu các phân đoạn
Sơ đồ nghiên cứu xác định thành phần hĩa học trong dịch chiết lá cây Rẻ quạt hình 2.16.
Hình 2.16. Sơ đồ nghiên cứu xác định thành phần hĩa học trong dịch chiết lá cây Rẻ quạt Xử lý sơ bộ: làm sạch, phơi khơ, nghiền mịn -Xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro -Xác định hàm lƣợng kim loại nặng Bột dƣợc liệu khơ Lá cây Rẻ quạt
Chiết soxhlet với dung mơi
(Khảo sát thời gian chiết tốt nhất, tỷ lệ R-L)
dichloromethane ethyl acetate
n-hexane Methanol Dịch chiết n-hexane Bã Dịch chiết dichloro methane Bã Dịch chiết ethyl acetate Bã Dịch chiết methanol Bã Đo GC-MS Đo GC-MS Đo GC-MS Đo GC-MS
Sơ đồ điều chế cao chiết ethyl acetate đƣợc trình bày trên sơ đồ hình 2.17.
Hình 2.17. Sơ đồ điều chế cao chiết ethyl acetate
Lá cây Rẻ quạt
Xử lí sơ bộ: làm sạch, phơi khơ, nghiền mịn
Bột Rẻ quạt
- Chiết chƣng ninh trong dung mơi ethyl acetate trong 10 giờ ở 770C
- Lọc
Bã Dịch chiết ethyl acetate
Chƣng cất đơn cơ đuổi dung mơi
Cao ethyl acetate
Loại béo bằng dietyl eter
Đo t0 nc
-Kiểm tra phân đoạn bằng SKBM
-Cơ quay chân khơng Cao Chloroform
(6g) Cơ đuổi dung mơi
-Khảo sát lựa chọn dung mơi giải li
bằng SKBM
-Chạy SKC phân Thu đƣợc các phân đoạn chất -Kiểm tra các phân đoạn
bằng SKBM
-Cơ quay chân khơng các phân đoạn giống nhau thu đƣợc
Cao ethyl acetate đã loại béo
- Khảo sát chọn dung mơi kết tinh lại
- Chuẩn bị dung dịch kết tinh trong dung mơi Chloroform
- Lọc
Cặn rắn
- Chƣng ninh với dung mơi Chloroform
- Lọc nĩng Bã Dịch lọc khơng màu Dịch lọc 1 Thực hiện kết tinh chất Tạo tinh thể Gạn lấy và làm khơ Tinh thể
-Khảo sát lựa chọn dung mơi giải li bằng SKBM - Chạy SKC để tinh chế chất Phân đoạn hợp chất TT Xác định cấu trúc bằng các pp phổ: phổ IR, phổ MS, phổ 1H-NMR, 13C-NMR Cao chất của các phân đoạn Chất rắn TT Xác định điểm chảy
Sơ đồ tạo tinh thể bằng phƣơng pháp kết tinh lại, đồng thời tinh chế chất rắn kết tinh thu đƣợc bằng phƣơng pháp sắc kí cột đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình 2.18.
Hình 2.18. Sơ đồ tạo tinh thể bằng phương pháp kết tinh lại, tinh chế chất rắn kết tinh thu được bằng phương pháp sắc kí cột
55