CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Phƣơng pháp tách và tinh chế chất
Cao chiết thu đƣợc đƣợc tách và tinh chế bằng phƣơng pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các đơn hoặc hệ dung mơi thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thƣờng và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel. Đối với các chất phân cực cĩ thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngƣợc pha Rp–18. Trƣờng hợp cần thiết cĩ thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng nhƣ theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với đơn hoặc hệ dung mơi thích hợp.
Phƣơng pháp kết tinh lại
Kết quả cuối cùng của quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế là phải thu đƣợc tinh thể nguyên chất, ngoại trừ các hợp chất lỏng.
Đây là phƣơng pháp quan trọng nhất để tinh chế các chất rắn. Cơ sở lí thuyết của phƣơng pháp là dựa vào sự khác nhau về độ tan của các chất trong một dung mơi hay hệ dung mơi ở các nhiệt độ khác nhau, cũng nhƣ sự khác nhau về độ tan vào dung mơi của chất tinh chế và chất bẩn ở cùng một nhiệt độ. Quá trình chung là hịa tan chất rắn thành dung dịch bão hịa ở nhiệt độ sơi của dung mơi và khi để lạnh thì chất rắn kết tinh lại dƣới dạng tinh khiết.
Các bƣớc của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung mơi, hịa tan nĩng và lọc, để kết tinh ở lạnh, gạn tinh thể ra khỏi dung dịch mẹ và làm khơ tinh thể.
Trong các bƣớc trên việc chọn dung mơi thích hợp cĩ tầm quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh [2].
a. Chọn dung mơi
Việc lựa chọn dung mơi kết tinh rất quan trọng, hợp chất càng tinh khiết thì việc xác định cấu trúc càng chính xác, độ tinh khiết của hợp chất cần phải >95%.
Lựa chọn dung mơi tinh khiết dựa vào mối quan hệ cấu tạo phân tử của chất cần kết tinh và dung mơi kết tinh, thƣờng chất phân cực thì hịa tan vào dung mơi phân cực và ngƣợc lại. Khi chất kết tinh chƣa rõ cấu tạo thì phải thử hịa tan trong dung mơi từ khơng phân cực đến dung mơi phân cực.
Dung mơi phân cực thỏa mãn một số điều kiện sau:
- Hịa tan càng nhiều càng tốt chất cần kết tinh ở nhiệt độ sơi và càng ít càng tốt ở nhiệt độ thấp.
- Hịa tan càng ít càng tốt các tạp chất ở nhiệt độ sơi và càng nhiều càng tốt ở nhiệt độ thấp.
- Khơng tƣơng tác hĩa học với chất kết tinh ở nhiệt thƣờng cũng nhƣ nhiệt độ sơi.
độ sơi tƣơng đối cao, khoảng cách giữa nhiệt độ sơi của nĩ với nhiệt độ thƣờng càng xa thì càng cĩ nhiều thời gian để hình thành tinh thể; nhƣng cũng khơng nên cao quá vì sẽ khĩ bốc hơi trong quá trình kết tinh đồng thời nhiệt độ cao cĩ thể gây phân hủy chất kết tinh, độ sơi của dung mơi trong vịng 60- 800C là thích hợp) [3].
b. Cách xác đinh độ hịa tan một chất đối với dung mơi
Ở nhiệt độ thƣờng
- Lấy một loạt ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống nghiệm một lƣợng chính xác chất kết tinh khoảng 10-50mg.
- Dùng ống hút chia vạch 0,1ml lấy dung mơi cho vào với tinh thể lúc đầu ít, sau tăng dần đến khi hợp chất tan. Sau mỗi lần cho dung mơi lắc mạnh để ống hịa tan. Làm nhƣ vậy với các dung mơi khác nhau.
- Tỷ lệ giữa lƣợng chất rắn với thể tích dung mơi đủ để hịa tan hồn tồn là độ hịa tan của dung mơi ấy đối với chất rắn ở nhiệt độ thƣờng [3].
Ở nhiệt độ sơi
- Cách xác định độ hịa tan ở nhiệt độ sơi cũng tiến hành nhƣ trên nhƣng đun nĩng ống nghiệm bằng bếp cách thủy đến khi dung mơi sơi, quan sát sự hịa tan của các dung mơi đối với chất rắn.
- Khi khơng chọn đƣợc đơn dung mơi thì bắt buộc phải chọn hệ dung mơi. Nguyên tắc: lấy một dung mơi hịa tan chất kết tinh ở nhiệt độ thƣờng, sau đĩ chọn một dung mơi khơng hịa tan hoặc kém hịa tan chất tinh chế nhƣng phải tan trong dung mơi trên.
- Nếu cĩ nhiều chất cĩ độ tan khác nhau ở nhiệt độ khác nhau vào một dung dịch, ngƣời ta dùng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn. Ở một nhiệt độ xác định, một chất nào đĩ tan quá bão hịa sẽ kết tinh lại khi để lạnh, cịn chất kia chƣa bão hịa sẽ ở lại trong dung dịch.
sẽ lọc nĩng để loại bỏ chất bẩn, cịn chất kết tinh ở lại trong dung dịch sẽ kết tinh khi làm lạnh.
- Dung mơi đƣợc xem là tốt nếu đảm bảo dung mơi tan một phần chất rắn (hoặc tan hồn tồn càng tốt), để nguội sau đĩ cho vào tủ lạnh để yên thì chất rắn kết tinh lại; nếu dung mơi tan hồn tồn nhƣng để nguội chất rắn khơng kết tinh lại thì cĩ thể đƣợc xem là dung mơi kết tinh (trƣờng hợp cuối cùng để lựa chọn); cịn dung mơi khơng tan thì khơng đƣợc lựa chọn [3].