Đầu tiên, 0,5g Na-Alg-Cys hòa tan vào 20 mL nước cất đến khi đồng nhất sau đó mẫu tiếp tục khấy trong môi trường lạnh, nhiệt độ dưới 15 °C. Tương ứng với tỷ lệ ghép Alginate : Pluronic (1:5; 1:10; 1:15; 1:20) cân NPC–F127- OH có khối lượng lần lượt (2,5; 5,0; 7,5; 10 g) hoà tan trong nước cất ở nhiệt độ 4 °C, khuấy từ cho đến khi tan hoàn toàn. Dung dịch NPC-F127-OH được cho vào dung dịch Na-Alg-Cys khuấy và giữ lạnh ít nhất 24 h trước khi đem thẩm tách với mang cellulose (12.000-14.000 Da). Thẩm tách trong nước cất diễn ra trong khoảng 7 ngày trước khi đem mẫu đi đông khô. Sản phẩm thu được đem đi đo phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc.
2.4. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ POLYMER LÊN NHIỆT ĐỘ TẠO GEL NHIỆT ĐỘ TẠO GEL
2.4.1. Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép CS -F127
Copolymer ghép CS -F127 được hoà tan hoàn toàn trong các ống nghiệm chứa nước cất (5, 8, 10, 12, 15 và 20 % w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt. Đánh giá khả năng nhạy nhiệt của dung dịch copolymer ghép bằng phương pháp khảo sát sự chuyển trạng thái sol-gel của dung dịch chitosan- Pluronic F127 ở khoảng nhiệt độ tử 15 đến 50 °C. Các hydrogel được điều chế với các tỷ lệ Pluronic F127 khác nhau và cố định hàm lượng chitosan. Các mẫu hydrogel có hàm lượng chitosan so với Pluronic là 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 %wt/wt.
tan hoàn toàn thành dung dịch nhớt. Bể ổn nhiệt được chỉnh ở các nhiệt độ từ 15 °C đến 50 °C, mỗi phép đo cách nhau 5 °C. Trước mỗi phép đo, bể nhiệt được để ổn định với nhiệt độ được điều chỉnh ít nhất 5 phút trước khi tiến hành ngâm ống nghiệm. Ở mỗi nhiệt độ, ống nghiệm được đặt trong bể ủ nhiệt trong vòng 10 phút trước khi tiến hành khảo nghiệm, sau đó các ống nghiệm này được đưa về nhiệt độ 4 °C để kiểm tra khả năng phục hồi trạng thái dung dịch của mẫu. Nếu dung dịch trong ống nghiệm không chảy được khi đảo ngược ống, trạng thái được ghi nhận tạo gel. Nếu dung dịch trong ống nghiệm chảy khi đảo ngược, trạng thái của mẫu là dung dịch.
2.4.2. Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép Alg -F127
Sự chuyển pha của dung dịch Alg -F127 được nghiên cứu bằng phương pháp đảo ống nghiệm. Các Alg -F127 được điều chế với các tỷ lệ Pluronic F127 khác nhau từ 5, 10, 15 và 20 lần so với trọng lượng của Na-Alg-Cys. Theo đó các mẫu được đặt tên tương ứng như sau: Alg -F127 (5), Alg -F127 (10), Alg - F127 (15), Alg -F127 (20). Các mẫu dung dịch Alg-F127 đều cho kết quả chuyển pha phụ thuộc vào nhiệt độ và hàm lượng Pluronic có trong mẫu.
2.4.3. Khảo sát thời gian giảm cấp của các hydrogel copolymer ghép
Các hydrogel Alg -F127 và CS -F127 có nhiệt độ chuyển pha sol-gel nằm trong khoảng từ 30 °C đến dưới 37 °C là đối tượng được lựa chọn trong nghiên cứu này. Khả năng hấp thụ nước và giảm cấp cấu trúc của các hydrogel được đánh giá trong ba môi trường: PBS 1X (gibco, không chứa Mg2+, Ca2+), PBS 1X + 1% collagenase (2mg/mL) và môi trường DMEM bổ sung 10% FBS. Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường 37 °C, đặt trong môi trường vô khuẩn. 0,5mL các gel ( mL) được lựa chọn cho vào ống nghiệm 5mL có nắp đậy và được để ổn định trong môi trường lạnh 2-8 °C trước khi sử dụng 1 ngày. Sau đó, các ống nghiệm được đặt trong tủ 37 °C trong 3 giờ để đảm bảo gel hình thành. Mơi trường được ủ ấm trong bể ủ 37 °C trước sử dụng. Các ống nghiệm được cân trước khi cho 4,5mL môi trường ngâm vào. Tại các thời điểm đã chọn, môi trường ngâm được loại bỏ và cân ghi nhận kết quả m2. Khả năng hấp thụ
Hàm lượng nước hấp thụ = (𝑚2−𝑚1)
𝑚1 𝑥100% (2.1)
Tốc độ phân rã của hydrogel được tính bằng cơng thức:
Tốc độ phân rã = 𝑚𝑓−𝑚𝑚
𝑡𝑓−𝑡𝑚 (2.2)
Trong đó mf là khối lượng tối thiểu cịn lại trước khi bị phân rã hồn tồn thời gian tf là thời gian thu nhận được giá trị mf, mm là khối lượng tối đa của hydrogel thu được và tm là thời điểm đạt khối lượng tối đa của hydrogel trong môi trường ngâm.
2.5. ĐIỀU CHẾ, KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HỆ HYDROGEL NHẠY NHIỆT MANG, NHẢ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC NHẠY NHIỆT MANG, NHẢ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC
2.5.1. Điều chế hệ hydrogel có mang các loại thuốc/hoạt chất sinh học
Trên cơ sở các công bố trước về tác động của các hoạt chất được nghiên cứu lên hiệu quả tăng sinh nguyên bào sợi cũng như tác động lên quá trình chữa lành vết thương tiểu đường [66-68]. Hàm lượng 2 hoạt chất được nang hóa
trong 2 nền hydrogel như trong bảng 2.3. Trong nghiên cứu này các hệ CS - F127(15) và Alg -F127(10) tạo gel ở 20% được điều chế để mang các hoạt chất trên.
Bảng 2.3. Hàm lượng 2 hoạt chất được nang hóa trong 2 nền hydrogel
Hoạt chất Nồng độ trong hydrogel (µM/ppm)
Quercetin (QU) 20/6
Resveratrol (RE) 12/2,74
2.5.1.1. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU
Hịa tan hồn tồn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4°C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ). Cho vào dung dịch trên 123µg QU hoạt chất. Khấy đều trong 30 phút tốc độ 200 vịng/phút ở nhiệt độ 0°C. Đơng khơ mẫu được sản phẩm cuối cùng chứa 6ppm QU trong hệ gel 18% CS -F127/ Alg -F127.
2.5.1.2. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang RE
Hịa tan hồn tồn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4 °C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ). Cho vào dung dịch trên 56,17 µg RE hoạt chất. Khấy đều trong 30 phút tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 0 °C. Đông khô mẫu được sản phẩm cuối cùng chứa 2,74 ppm RE trong hệ gel 18% CS -F127/ Alg -F127.
2.5.1.3. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU và RE
Hịa tan hồn tồn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4°C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ). Cho vào dung dịch trên 123µg QU và 56,17 µg RE. Khấy đều trong 30 phút tốc độ 200 vịng/phút ở nhiệt độ 0°C. Đơng khơ mẫu được sản phẩm cuối cùng chứa 2,74 ppm RE và 6ppm QU trong hệ gel 18% CS -F127/ Alg -F127
2.5.2. Xác định hàm lượng QU và RE được nang hóa trong hệ hydrogel
Hàm lượng RE và QU chứa trong hệ hydrogel CS -F127/ Alg -F127 được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại UV-Vis (Agilent 8453 UV-Vis Spectrophotometer) với bước sóng hấp thu lớn nhất ở 324 nm (RE) và 374 nm (QU). RE tinh khiết được hòa tan trong DMSO : PBS (1:1) ở nồng độ 0 -12 ppm. QU tinh khiết được hòa tan trong ethanol : PBS (1:1) ở nồng độ 0 -5 ppm để dựng đường chuẩn. Mẫu được cho vào cuvet đặt trong máy Agilent 8453 UV-Vis Spectrophotometer và tiến hành đo. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ giữa nồng độ RE/QU và độ hấp thụ là phương trình đường thẳng dạng y = ax + b, trong đó y là độ hấp thụ còn x là nồng độ.
2.5.3. Kiểm tra tính nhạy nhiệt và xác định điểm chuyền pha của hệ hydrogel CS -F127/ Alg-F127 mang QU, RE và QU + RE hydrogel CS -F127/ Alg-F127 mang QU, RE và QU + RE
Phương pháp inverted tube: Đối với phương pháp đảo ngược ống,
copolymer ghép mang các hoạt chất được hoà tan hoàn toàn trong các ống nghiệm chứa nước cất (12, 14, 16, 18 và 20 %w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt. Đánh giá khả năng nhạy nhiệt của dung dịch copolymer ghép mang hoạt chất bằng phương pháp khảo sát sự chuyển trạng thái sol-gel của dung dịch CS
trong nước lạnh dưới dưới 10 °C để đảm bảo sự hịa tan hồn tồn thành dung dịch nhớt, các lọ chứa 1 g hydrogel được ủ trong bể nước gia nhiệt ở 15 °C trong 20 phút, để cho phép các mẫu cân bằng nhiệt với môi trường của chúng. Sau đó, nhiệt độ được tăng lên (2 °C/10 phút) từ 15 °C đến 60 °C. Mỗi lần tăng, các mẫu được lấy ra khỏi bể nước (tối đa 30 giây để ngăn chuyển pha do nhiệt độ bên ngoài) và được đảo ngược để quan sát hành vi của chất lỏng / gel. Các mẫu được phân thành ba loại: (1) chất lỏng khi mẫu di chuyển nhanh theo hướng trọng lực; (2) chất lỏng nhớt hoặc gel mềm khi mẫu di chuyển chậm xuống theo hướng trọng lực; (3) gel cứng khi mẫu vẫn ở dưới đáy lọ. Nhiệt độ tại đó mẫu được phân loại là gel cứng được gọi là điểm sol-gel (Tgel ). Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong ba lần dưới sự quan sát của một người.
2.5.4. Khảo sát và đánh giá khả năng nhả các hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel theo thời gian hydrogel theo thời gian
2.5.4.1. Khảo sát và đánh giá về khả năng nhả hoạt chất ra khỏi hệ
hydrogel
Khả năng phóng thích hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel được khảo sát dựa trên phương pháp khuyếch tán hoạt chất (RE/QU) trong hydrogel được chứa trong màng thẩm tách. Túi thẩm tách có khối lượng phân tử 3,5 kDa chứa 2 mL mẫu (hydrogel nồng độ 18%) được treo lơ lửng trong 20 mL dung dịch phosphate-buffered saline (PBS) có pH = 7,4 được đặt trong bể điều nhiệt và khuấy ở 37 ± 1 °C, tốc độ khuấy là 100 vòng/phút. Đối với RE/QU tự do được thực hiện như trên DMSO (RE); EtOH (QU) được sử dung để hòa tan hoạt chất với nồng độ 200ppm. Ở mỗi khoảng thời gian khác nhau (0h, 1h, 3h, 5h, 7h, 9h, 12h, 24h, 36h, 48h), 20 mL mẫu được rút ra, đồng thời thêm vào 20 mL dung dịch PBS để đảm bảo thể tích dung dịch đệm khơng đổi. Hàm lượng các hoạt chất giải phóng ra được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến như đã trình bày ở mục 2.5.2. Thí nghiệm giải phóng (RE/QU) được làm lặp lại 3 lần. Phần trăm hoạt chất giải phóng ra được tính bằng cơng thức (Wendy H. Chern) [69, 70]
Trong đó:
Q: Lượng thuốc được giải phóng từ hệ hydrogel (µg) Cn: Nồng độ ở thời điểm t (ppm)
Vs: Thể tích của PBS (mL) Vt: Thể tích mẫu (mL)
∑𝑛−1𝑖=1 𝐶𝑛−1: Nồng độ của thuốc được giải phóng theo thời gian (ppm)
2.5.4.2. Nghiên cứu động học giải phóng thuốc khỏi hệ hydrogel
Động học giải phóng thuốc đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng mơ hình các Zero-order, First-order, Higuchi, Hixson-Crowell, Power law và Ritger-Peppas. Trong đó Mơ hình Power law và Ritger-Peppas dùng để giải thích rõ cơ chế giải phóng thuốc.
Mơ hình Power law: Mt /M∞ = Ktn (2.4)
Trong đó M t / M ∞ là phần của thuốc giải phóng tại mỗi thời gian (t), K là một hằng số động học kết hợp các đặc điểm về cấu trúc và hình học của thiết bị, và n là số mũ giải phóng, dấu hiệu của cơ chế giải phóng thuốc. Phương trình (2.4) có hai ý nghĩa riêng biệt, một trong trường hợp đặc biệt là n = 0,45 (biểu thị sự phóng thích thuốc được kiểm sốt theo cơ chế khuếch tán, cịn được gọi là động học khuếch tán Fickian), và lần thứ hai trong trường hợp đặc biệt là n = 0,89 (chỉ ra sự phóng thích thuốc được kiểm sốt xói mịn trường hợp vận chuyển động học II). Giá trị của n trong khoảng 0,45 đến 0,89 có thể được coi là một chỉ số cho sự lồng ghép của cả hai hiện tượng (vận chuyển dị thường).
Mơ hình Ritger–Peppas: Mt/M∞ = Katm + Kbt2m (2.5)
Trong đó Mt/M∞ là phần thuốc được giải phóng ở mỗi mốc thời gian (t) và Ka, Kb và m là các hằng số. Phương trình này trước đây được đề xuất để mơ tả sự giải phóng các phân tử từ khối polymer khi khuếch tán không phải là yếu tố quyết định duy nhất để phóng thích. Giá trị m là 0,45 được lấy trong nghiên cứu của chúng tôi dựa trên tỷ lệ 2a/l (a là đường kính màng, l là chiều dài màng
thẩm tách đem đi giải phóng hoạt chất) giá trị này nhỏ hơn 0,1 thì hệ số m là 0,45 [71-73].
2.5.4.3. Xác định thời gian T1/2 giải phóng một nửa thuốc in vitro
Khảo sát đánh giá về T1/2 (thời gian một nữa lượng thuốc giải phóng ra khỏi chất mang/hydrogel): Thời T1/2 các hoạt chất ra khỏi hydrogel là thời gian cần thiết cho một nửa lượng hoạt chất được phóng thích ra khỏi hệ. Dữ liệu giải phóng thuốc in vitro được sử dụng với mơ hình động học bậc 1 để tính thời gian T1/2 của hoạt chất. Các thông số C max (nồng độ đỉnh cao nhất), T max (thời gian mà tại đó C max đạt) được ghi nhận lại [74].
2.5.5. Khảo sát và đánh giá thời gian giảm cấp của hệ hydrogel hoạt tính trong mơi trường giả sinh học trong mơi trường giả sinh học
2 mẫu hydrogel CS -F127/ Alg-F127 chứa 2 hoạt chất (QU, RE) có tổng thể tích 2mL được điều chế trong 2 ống nghiệm. Sau đó để ổn định tại nhiệt độ 4 °C trong vòng 1-2 giờ để mẫu hydrogel đồng nhất. Tiếp theo để vào máy ủ nhiệt ở 37 °C trong 30 phút để tạo thành gel rắn. Lấy mẫu đem cân để xác định khối lượng ban đầu (Wi). Để mẫu vào lại máy ủ nhiệt cho thêm 5 mL PBS pH 7,4 hoặc DMEM. Sau mỗi 2 ngày, lấy ống nghiệm loại bỏ hết dung dịch PBS, đem cân trên cân điện tử và ghi nhận kết quả; bổ sung lại 5 mL PBS 7,4 hoặc DMEM. Lặp lại quy trình đến khi hydrogel phân rã hết. Các mẫu được lặp lại 3 lần trong cùng điều kiện khảo sát.
Phần trăm khối lượng suy giảm được tính như sau:
(2.6) Trong đó: Wi khối lượng gel ban đầu (g);
Wt khối lượng gel còn lại sau khoảng thời gian (t) đã bị giảm cấp (g).
2.5.6. Khảo sát và đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong hệ hydrogel
Các hoạt chất được mang trong hydrogel được đánh giá độ ổn định theo thời gian. Các mẫu được pha ở nồng độ tạo gel và lưu trữ trong môi trường 4 °C (tủ lạnh) và 37 °C (bể điều nhiệt) thời gian 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 6 tháng. Sau thời gian khảo sát trên các mẫu được trích ra và đo UV-Vis nhằm xác định
nồng độ hoạt chất có trong hệ hydrogel. Các số liệu khảo sát được so sánh với số liệu ban đầu trước khi lưu trữ. Cụ thể 2 g mẫu copolymer chứa 2 hoạt chất được hịa tan hồn tồn trong 8 mL nước và lưu trữ trong môi trường 4 °C và 37 °C, Sau khoảng thời gian khảo sát, 0,5 mL hydrogel được lấy ra đem đi phân tích xác định hàm lượng hoạt chất có trong mẫu.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT CS -F127
3.1.1. Kết quả tổng hợp NPC-F127-NPC
Pluronic có hai đầu hydroxyl là vị trí diễn ra phản ứng thế, tuy nhiên do mạch Pluronic dài và cồng kềnh nên phản ứng thế ái điện tử rất khó diễn ra; vì vậy Pluronic cần được hoạt hố với một nhóm xuất như NPC để làm tăng khả năng Pluronic phản ứng với các nhóm amine trên mạch chitosan. Trong nghiên cứu này, Pluronic được hoạt hố hai đầu tại nhóm hydroxyl bằng NPC. Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-F127-NPC được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân hình 3.1.