CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT CS-F127
3.1.1. Kết quả tổng hợp NPC-F127-NPC
Pluronic có hai đầu hydroxyl là vị trí diễn ra phản ứng thế, tuy nhiên do mạch Pluronic dài và cồng kềnh nên phản ứng thế ái điện tử rất khó diễn ra; vì vậy Pluronic cần được hoạt hố với một nhóm xuất như NPC để làm tăng khả năng Pluronic phản ứng với các nhóm amine trên mạch chitosan. Trong nghiên cứu này, Pluronic được hoạt hố hai đầu tại nhóm hydroxyl bằng NPC. Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-F127-NPC được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-NPC
Phổ đồ hình 3.1 có các tín hiệu mũi cộng hưởng đặc trưng ở = 1,08 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên dây PPO ở vị trí nhóm (-CH3). Một mũi ở vị trí 3,2-3,5 chứng tỏ sự có mặt của proton H trên PPO ở vị trí (-CH2, -CH). Một mũi ở vị trí 3,62 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên dây PEO ở vị trí nhóm (-CH2-CH2-). Đặc biệt là tín hiệu ở vị trí = 4,42 ppm chứng tỏ sự có mặt
của proton H trên dây PEO ở vị trí nhóm (CH2-O-NPC). Tín hiệu này chỉ xuất hiện khi pluronic được hoạt hóa với NPC. Ngồi ra, cịn có hai mũi đơi ở vị trí
= 7,38 ppm và = 8,22 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên NPC của vòng benzen. Từ phổ 1H-NMR cho thấy gắn thành công NPC vào hai đầu F127.
3.1.2. Kết quả tổng hợp NPC-F127-OH
Để ngăn sự hình thành F127–dimer do nhóm NPC rất dễ dàng bị thay thế, một lượng 3-amino-1-propanol được sử dụng để khoá một đầu NPC trên mạch của Pluronic đã được hoạt hố. Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC- F127-OH được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân hình 3.2.
g TMS c CDCl3 f a b d e f’ f’’
Hình 3.2. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-OH
Qua phổ đồ 1H-NMR ở hình 3.2 cho thấy việc khố nhóm NPC trên Pluronic thành công. Đối với sản phẩm thế một phần 3-amino-1-propanol của F127 hoạt hóa NPC, ngồi những peak cộng hưởng đặc trưng cho các proton trên NPC-F127-NPC thì ta cịn thấy có tín hiệu peak cộng hưởng ở vị trí =
3-amino-1-propanol (thể hiện proton H trên dây PEO liên kết trực tiếp với nhóm (-OC-NH-). Độ thế 3-amino-1-propanol càng cao, tín hiệu ở = 4,22
ppm sẽ càng tăng cường độ. Một mũi ở vị trí = 1,70 – 2,2 ppm là của proton H trên C bão hịa khơng liên kết trực tiếp với N nằm trong nhóm 3-amino-1- propanol (-CO-NH-CH2-CH2-). Chứng tỏ 1 đầu NPC được thay thế bởi 3- amino-1-propanol. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 (B) (A) (5) (4) (3) (2) (1) NPC-F127-OH NPC-F127-NPC F127 Tần số (cm-1)
Hình 3.3. Kết quả phổ FTIR của NPC-F127-OH
Mũi vị trí (1): 3456,40 cm-1; 3423,50 cm-1; 3451,31 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết O-H trên Pluronic F127. Mũi vị trí (2): (2971,37-2874,96) cm-
1; (2971,82-2871,72) cm-1; (2971,33-2879,71) cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C-H của nhóm -CH2-, -CH3 trên Pluronic F127 [75]. Mũi vị trí (3): 1769,49 cm-1; 1769,18 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C=O trong nhóm ester do sự tạo liên kết của Pluronic F127 với p-nitrophenyl chloroformate [76]. Mũi vị trí (4): 1526,43 cm-1; 1523,96 cm-1 là dao động nhóm hóa trị trong nhóm nitro – NO2 liên kết trực tiếp với nhân thơm trên phân tử p-nitrophenyl chloroformate
[77]. Mũi vị trí (5): 1108,41 cm-1; 1109,04 cm-1; 1106,96 cm-1 là dao động hóa trị đối xứng của liên kết C-O-C trên Pluronic F127. 1642,29 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C=O trong nhóm amide do sự thay thế một phần gốc p-
nitrophenyl chloroformate bằng 3-aminopropane-1-ol thông qua liên kết amide với Pluronic F127 [78].
Qua phổ FT-IR ở hình 3.3 chứng minh hợp chất NPC-F127-OH có sự xuất hiện đồng thời các hấp thụ đặc trưng của F127, p-nitrophenyl chloroformate và 3-aminopropane-1-ol, chứng tỏ đã tổng hợp thành công sản phẩm NPC-F127- OH.
3.1.3. Kết quả tổng hợp CS -F127
CS -F127 được tổng hợp dựa trên phản ứng tạo nhóm carbamate thơng qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm carbonate (NPC-F127-OH) và nhóm amino (NH2) của chitosan.
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của copolymer ghép CS -F127
Phân tích kết quả 1H-NMR (hình 3.4) của vật liệu ghép cho thấy bên cạnh sự biến mất của các tín hiệu cộng hưởng do proton của NPC (δ = 7,39 ppm và 8,27 ppm), các chuyển dịch hóa học của proton có trên glucosamine (đơn vị acetyl CH3C(O)- và đơn vị deacetylated) của chitosan tại δ= 1,98 ppm (h1), δ= 2,84 ppm (h2) và δ= 4,62 ppm (h3). Bên cạnh đó, tín hiệu cộng hưởng của proton Pluronic tại chuyển dịch hóa học δ= 1,03 (ha), đặc trưng của proton trên nhóm methyl của phân tử pluronic vẫn xuất hiện trên phổ 1H NMR. Từ kết quả
phân tích 1H-NMR cho thấy đã thành cơng trong việc tạo ra vật liệu ghép CS - F127 thông qua trung gian p-NPC.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Tần số (cm-1)
CS-F127 CS
NPC-F127-OH
Hình 3.5. Kết quả phổ FTIR của CS-F127 (1:15)
Kết quả FTIR (Hình 3.5) cho thấy đặc điểm dải phổ của chitosan chuẩn ở số sóng 3368 cm-1 là do dao động giãn của liên kết OH, 1559 cm-1 là dao động liên kết NH, tín hiệu này cũng xuất hiện trong dải phổ CS-F127(1:15) ở số sóng 3491 cm-1 dao động liên kết O-H, 1468 cm-1 dao động liên kết N-H.
Dao động của các liên kết trong dải phổ F127-OH cho thấy ở số 2886 cm- 1 là dao động giãn của liên kết CH trong phân đoạn PEO của Pluronic F127. Dao động giãn ở số sóng 1111 cm-1 do dao động liên kết CO đặt trưng của Pluronic F127. Các tín hiệu này cũng xuất hiện ở dải phổ CS-F127 ở số sóng 2890 cm-1 là dao động giản của liên kết CH. Dao động ở bước sóng 1112 cm- 1 do dao động giãn của liên kết CO. Tín hiệu khoảng 1571 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng –NH của nhóm amine trong CS, tuy nhiên trong phổ đồ của CS-F127 khơng có tín hiệu ở vị trí này có thể do nhóm amine của CS đã được liên kết với F127 tạo thành nhóm amide I có vân hấp thụ khoảng 1650
cm-1 [79], Tóm lại, dữ liệu phổ FT-IR cho thấy các vân phổ phù hợp với các nhóm chức trong công thức cấu tạo dự kiến của copolymer ghép.
Dựa vào dữ liệu phổ FT-IR, 1H-NMR và so sánh với các tài liệu tham khảo, chứng tỏ rằng đã tổng hợp thành công hệ copolymer ghép CS-F127 3.2. KẾT QUẢ TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT ALG -F127
3.2.1. Kết quả tổng hợp Na-Alg-Cys
Để tạo các nhóm amine trên mạch Natri Alginate (Na-Alg) cho phản ứng với NPC-F127-OH, cystamine được sử dụng như tác chất. Cystamine cịn có cấu trúc 2 nhóm NH2, một nhóm tạo liên kết với nhóm carboxylate có trên Alg trong khi cịn dư một nhóm NH2 tự do để tạo liên kết với NPC-F127-OH. Một nghiên cứu về vết thương gây bởi sưng năm 1984 [80], cho thấy việc tiêm cystamine vào bắp đùi thỏ bị gây tổn thương đã làm giảm thời gian của phản ứng viêm và thúc đẩy hoạt động của đại thực bào và thúc đẩy q trình biệt hóa của nguyên bào sợi làm tăng cường quá trình tổng hợp collagen do đó vết thương được điều trị bằng cystamine lành sớm hơn so với lơ chứng 4-5 ngày. Năm 2012, nghiên cứu của nhóm Toshio Fujisawa [68] đã chỉ ra rằng cystamine có tác dụng ức chế hoạt động của Matrix Metalloproteinases (MMP, men tiêu hủy cấu trúc nền). MMPs còn ngăn cản nguyên bào sợi sản sinh mới collagen, elastin... khiến cấu trúc nền khơng được phục hồi [81]. Do đó, cystamine thích hợp cho nghiên cứu này.
Phổ FTIR của Na-Alg (Hình 3.6) xuất hiện dãy hấp thu với cường độ mạnh ở bước sóng 3411 cm-1, đặc trưng cho sự dao động giãn nhóm của –OH, bên cạnh là dãy có cường độ yếu hơn nhiểu tại các bước sóng 2923cm-1 ứng với dao động giãn đối xứng của chuỗi CH2. Trên phổ cịn xuất hiện hai tín hiệu ở bước sóng 1619 cm-1 và 1412 cm-1, chứng minh sự hiện diện của dao động giãn đối xứng và bất đối xứng của nhóm carboxylate [82]. Ngồi ra trong vùng 1294–815cm-1 xuất hiện một số dao động của nhóm chức ether C-O-C và C-C trong liên kết glucoside [83]. Mũi dao động tại 815 cm-1 và 890 cm-1 chứng tỏ sự hiện diện của mannuronic trong mẫu Na-Alg. Mũi dao động tại 1294cm-1
cystamine lên mạch, có sự giảm cường độ của giao động cùng với sự dịch chuyển của tín hiệu nhóm carboxylate xuống 1634cm-1 và 1468 cm-1. Chứng tỏ sự hình thành liên kết amide rút điện tử gây ảnh hưởng đến nhóm COO- alginate. Đặc biệt trên phổ gắn cystamine có sự xuất hiện 1 dao động dãn nối ở bước sóng 1700cm-1 tương ứng với tín hiệu của N-C=O của nhóm amide I [86] Việc ghép cystamine còn thay đổi cường độ hấp thụ của các dao động nối của guluronic acid và của mannuronic acid. Các dảy phổ trong vùng từ 1320 đến 780 cm-1 gây ra bởi dao động của liên kết C-O và C-C, từ tỉ lệ cường độ các dải, có thể dự đoán tương đối tỉ lệ G/M [85]. Cường độ lớn của các dãy tại 1294 cm-1 và 1037 cm-1 cho biết hàm lượng G cao. Trong khi đó, hàm lượng M nhiều hơn, tương ứng với cường độ mạnh của các dải tại, 815, 890 cm-1. So sánh tỉ lệ các dải phổ trên cho thấy, sau khi gắn cys cường độ tín hiệu tại 1037 bị chuyển dịch xuống vùng dưới 1112 cm-1, trong khi cường độ các tín hiệu tại 815 cm-1
và 890cm-1 trở nên rõ nét, chứng tỏ hàm lượng M cao trong phổ ghép cao hơn, như vậy hầu hết cystamine được gắn chủ yếu trên nhóm carboxylate của guluronic acid. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Tần số (cm-1) Na-Alg-Cys Na-Alg Cys
Hình 3.6. Phổ FT-IR của Na-Alg, Cys và Na-Alg-Cys tổng hợp sử dụng
Phổ 1H-NMR của Na-Alg-Cys (Hình 3.7) cho thấy tín hiệu cộng hưởng ở 5,05ppm và 4,45ppm là của proron ở C-1 của đơn vị guluronate (H-1-G) [87] và mannuronate (H-1-M) [88, 89]. Bên cạnh đó, phổ Na-Alg-Cys cịn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng ở 4,93 ppm và 4,20 ppm tương ứng lần lượt với proton ở C-5 của đơn vị guluronate (H-5-G) và mannuronate (H5-M) [90]. Trong khi H-5 của các đơn vị guluronate trong khối GG (H-5-GG) cho tín hiệu cộng hưởng ở 4,37 và các tín hiệu cộng hưởng ở 4,45 và 4,68 là của H-1 của đơn vị mannuronate và H5 của đơn vị guluronate trong các đơn vị thuộc khối GM (H- 1-M+ H-5-GM). Bên cạnh các tín hiệu đặc trưng của Na-Alg, phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu mới ở 3,4ppm và 3,1ppm, 2 tín hiệu đặc trưng của proton có trên phổ 1H-NMR của Cystamine. Đối chiếu với phổ 1H-NMR của cystamine tự do và các công bố về phổ Na-Alg [82, 89], tín hiệu proton tại 2,97ppm khơng thuộc về của 2 thành phần cấu thành nên nó. Tín hiệu này có thể được sinh nhờ sự hình thành do sự amide hóa của nhóm carboxylate. Như vậy, thơng qua đánh giá cấu trúc bằng 1H-NMR và FT-IR, sản phẩm Na-Alg-Cys được tổng hợp thành cơng.
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của Na-Alg-Cys trong dung môi D2O.
3.2.2. Kết quả tổng hợp Alg -F127
đã hoạt hóa giống với quy trình đã tổng hợp CS-F127. Cấu trúc hóa học của hợp chất được xác định thông qua phổ FT-IR và 1H-NMR trong môi trường nước. Trên phổ FT-IR của Alg-F127 các mũi dao động đặc trưng của Na-Alg, cys và F127 đều xuất hiện. Tần số hấp thụ của dao động NH và C=O trong liên kết amide được thể hiện rõ ràng hơn trong phổ ghép. Đặc biệt sự xuất hiện tín hiệu hấp thụ mạnh của amide I và II ở số sóng 1600 đến 1700 cm-1. Độ hấp thu của tín hiệu đặc trưng cho mannuronic acid dường như khơng có sự thay đổi đáng kể, tuy nhiên các tín hiệu của guluronic acid tại 1294cm-1có sự chuyển dịch sang vùng trên 1281cm-1. Mũi 1241 cm-1 cũng xuất hiện trên phổ ghép những với độ sắc nét và rõ ràng hơn khi so sánh với phổ Na-Alg-Cys. (Hình 3.8). 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Tần số (cm-1) NPC-F127-OH Na-Alg-Cys Alg-F127
Hình 3.8. Phổ FT-IR của Alg-F127 (1:10)
Sau khi ghép F127 lên, tín hiệu cộng hưởng của proton trên guluronate (H-1-G) và mannuronate (H-1-M) xuất hiện với cường độ rất thấp, do sự phản chắn mạnh nhất của hai nguyên tử oxi kề với chúng và sự phản chắn bởi nguyên tử oxi từ liên kết trục (axial) là mạnh hơn từ liên kết xích đạo (equatorial) sau
khi được ghép với Pluronic F127. Chỉ cịn tín hiệu của proton trên mannuronic acid, MH5, MH4 và MH3 xuất hiện trên phổ cộng hường từ tại các vị trí 3,73ppm, 3,71ppm và 3,9 ppm như trong Hình 3.9 [90]
Hình 3.9. Phổ 1HNMR của Alg-F127
Ngồi các tín hiệu đặc trưng của Na-Alg-Cys, phổ cịn cho thấy tín hiệu ở trường mạnh δ =3,64 ppm tương ứng với proton của –CH2CH2– thuộc chuỗi PEO của pluronic.
Dựa vào dữ liệu phổ FT-IR, 1H-NMR và so sánh với các tài liệu tham khảo, chứng tỏ rằng đã tổng hợp thành công hệ copolymer ghép Alg-F127. 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ POLYMER LÊN NHIỆT ĐỘ TẠO GEL
3.3.1. Kết quả khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép CS-F127 Bảng 3.1. Khảo sát nhiệt độ tạo gel của copolymer ghép và khả năng chuyển đổi từ gel sang dung dịch và ngược lại.
F1 ( 1:1) 0,25 0,25g -- -- -- -- -- F2 (1:2) 0,25 0,5g -- -- -- - + F3 (1:3) 0,25 0,75g -- -- -- + + F4 (1:4) 0,25 1g -- -- -- + + F5 (1:5) 0,25 1,25g -- -- + ++ + F6 (1:10) 0,25 2,5g -- -- ++ ++ ++ F7 (1:15) 0,25 3,75g -- -- +++ +++ +++ F8 (1:20) 0,25 5g -- + +++ +++ +++
(---: khơng có khả năng tạo gel; +: tạo gel yếu; ++: tạo gel khá tuy nhiên gel chưa đặc lại hồn tồn; +++: tạo gel tốt, gel đơng đặc khơng chảy khi đặt nghiêng)
Hình 3.10. Chuyển hóa sol-gel của các dung dịch CS-F127 ở 10 °C va 37 °C
Đặc tính nhạy nhiệt của dung dịch copolymer ghép CS-F127 được nghiên cứu bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm và kết quả được thu nhận vào bảng 3.1. Tất cả các mẫu được đặt trong bể nhiệt có nhiệt độ từ 4 °C đến 90 °C khoảng 1 phút, sau đó quan sát khả năng chảy của dung dịch trong ống để xác định trạng thái của vật liệu. Như kết quả trình bày trong bảng 3.1, mẫu F1 khơng cho thấy có sự thay đổi trạng thái trong khoảng nhiệt độ thử nghiệm. Khi nồng
độ Pluronic tăng lên 200 % so với trọng lượng chitosan (mẫu F2), khi ống mẫu đặt trong bể nhiệt 30-50 °C, độ nhớt của dung dịch tăng làm cản trở quá trình chảy. Hàm lượng pluronic F127 càng tăng, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ chảy của dung dịch mẫu càng giảm. Tuy nhiên, từ mẫu F2 đến F6 khả năng tạo gel vẫn chưa đáp ứng yêu cầu tạo thành màng gel rắn không chảy khi đặt nghiêng (Hình 3.10).
Mẫu F7 và F8 có gel hình thành tốt ở nhiệt độ của cơ thể con người (30- 40 °C), tuy nhiên mẫu F8 với tỷ lệ chitosan/ pluronic là 1:20 cho thấy gel có thể hình thành ở nhiệt độ 25 °C. Như vậy, nhiệt độ tạo gel càng thấp khi tăng