CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ, KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HỆ
3.4.3.3. Kết quả khảo sát đánh giá về T1/2 của hệ hydrogel mang hoạt chất
Bảng 3.6. Giá trị T1/2 của các hoạt chất phóng thích ra từ các nền
hydrogel mang đơn chất
Mẫu Tham số C0 (µg/mL) Tmax (h) Cmax (µg/mL) T1/2 (h) C1/2(µg/mL) k R² QU 10 1 5,56 3,65 5 0,190 0,981 CS-F127-QU 13,8 24 5,2 43,31 7 0,016 0,914 Alg-F127-QU 7,5 12 3,45 17,77 4 0,039 0,986 RE 8,5 1 3,2 4,95 4 0,140 0,935 CS-F127-RE 13,8 3 1,10 77,06 7 0,009 0,912 Alg-F127-RE 13,8 1 0,8 53,31 7 0,013 0,932
Bảng 3.6. là kết quả của dược động học theo phương trình tuyến tính bậc 1 cho kết quả T1/2 in vitro của QU tự do ra khỏi màng là 3 giờ 38 phút. Sau khi QU được mang trong hệ gel CS-F127/Alg-F127 thời gian phóng thich T1/2 đã tăng lên đáng kể gấp 4,87 lần với hệ Alg-F127 và 11,88 với hệ CS-F127, ở một số nghiên cứu cải thiện khả năng hòa tan và ổn định trong nước của QU, QU được mang trong các micelle polymer, kết quả cho thấy T1/2 được cải thiện cùng với sinh khả dụng đường uống tăng 286% so với QU tự do [95].
T1/2 của RE tự do là 4 giờ 57 phút. Khi được mang vào hệ Alg-F127 T1/2 tăng lên 53 giờ 18 phút và kéo dài nhất với CS-F127 T1/2 là 77 giờ, Kết quả cũng tương đồng với các nghiên cứu mang RE vào vật liệu chất mang cải thiện được T1/2 từ 4,4 đến 29,6 lần so với RE tự do [96].
Bảng 3.7. Giá trị T1/2 của các hoạt chất phóng thích ra từ các nền
hydrogel mang 2 hoạt chất
Mẫu Tham số C0 (µg/mL) Tmax (h) Cmax (µg/mL) T1/2 (h) C1/2 (µg/mL) k R² QU 10 1 5,56 3,65 5,0 0,190 0,981 CS-F127 mang 2 hoạt chất giải phóng QU 12 1 1,52 3,57 6,0 0,194 0,791 Alg-F127 mang 2 hoạt
chất giải phóng QU 12 24 2,59 5,64 6,0 0,123 0,980 RE 9 1 3,20 4,95 4,3 0,140 0,935 CS-F127 mang 2 hoạt
chất giải phóng RE 6 3 1,19 9,99 3,0 0,069 0,755 Alg-F127 mang 2 hoạt
chất giải phóng RE 6 40 1,44 6,68 3,0 0,104 0,886
T1/2 của các hoạt chất trong hệ hydrogel Alg-F127/CS-F127 mang 2 hoạt chất ngắn hơn so với Alg-F127/CS-F127 mang một hoạt chất. Với QU từ 17,77 giờ xuống còn 5,64 giờ (Alg-F127) và từ 43,31 giờ xuống 3,57 giờ (CS-F127). Hoạt chất RE T1/2 từ 53,31 giờ xuống còn 6,68 giờ (Alg-F127) và từ 77 giờ xuống còn 9,99 giờ (CS-F127). So sánh giá trị R2 của phương trình bậc 1, sự phụ thuộc của nồng độ hoạt chất giải phóng theo thời gian để áp dụng tính T1/2 . Mẫu CS-F127 mang 2 hoạt chất có giá trị R2 bằng 0,755 và 0,791 khi tính T1/2 của QU và RE. Điều này cho thấy sự khơng ổn định của q trình giải phóng hoạt chất QU và RE từ hệ CS-F127. Trong khi đó các giá trị R2 của Alg-F127 đều từ 0,886-0,98, cao hơn nhiều CS-F127, thể hiện sự ổn định hơn trong số liệu thu thập quá trình giải phóng hoạt chất QU và RE từ hệ Alg-F127.
Các giá trị này là tham khảo ban đầu cho cái nhìn khái qt, dự đốn được thời gian đạt được nồng độ thuốc tối ưu cho các thí nghiệm in vivo.
3.4.4. Khảo sát và đánh giá thời gian giảm cấp của hệ hydrogel hoạt tính trong mơi trường giả sinh học trong mơi trường giả sinh học
Khả năng giảm cấp sinh học của hydrogel được đánh giá bằng phương pháp phân tích khối lượng của hydrogel CS-F127 và Alg-F127 trong dung dịch PBS pH 7,4 hoặc DMEM đến khi hydrogel phân hủy hết, kết quả được thể hiện trong đồ thị ở hình 3.22. và hình 3.23. Theo như kết quả ghi nhận được trong môi trường đệm PBS pH 7,4 ta thấy hydrogel Alg-F127 có thời gian giảm cấp trong 12 ngày, kéo dài hơn gấp 2 lần so với mẫu hydrogel F127 (phân hủy hết trong 6 ngày) và gấp 1,2 lần so với mẫu CS-F127 (phân hủy hết trong 10 ngày). Điều này cho thấy việc kết hợp pluronic F127 với Alg/CS (là chất có khả năng kết dính sinh học) đã làm tăng độ bền của hệ hydrogel nếu so sánh với việc chỉ sử dụng một mình pluronic F127. Tính ổn định của hệ hydrogel tăng lên có thể được giải thích là Alg/CS làm tăng sự đan xen giữa các chuỗi copolymer phân nhánh dẫn đến việc làm tăng tính ổn định của hydrogel trong q trình phân hủy.
Hình 3.22. thể hiện sự giảm cấp của hệ hydrogel CS-F127 và Alg-F127 mang RE; QU với nền gel ban đầu và hệ hydrogel F127. Chúng ta thấy F127 có thời gian phân hủy ngắn, chỉ trong vịng 6 ngày khảo sát, 100% gel F127 bị phân hủy hết. Trong khi F127 ghép vô hệ CS và Alg. Thời gian phân hủy của hệ hydrogel được cải thiện đáng kể. Hệ CS-F127 có thời gian phân hủy đến 10 ngày, gấp 1,7 lần so với F127 gốc.Trong khi đó Alg-F127 có thời gian giảm cấp lên đến 12 ngày, gấp 2 lần so với F127. Trong 2 ngày đầu của khảo sát khối lượng mẫu Alg-F127 trước và sau khi mang hoạt chất (RE; QU) khối lượng đều tăng lên. Đây thể hiện khả năng giữ nước của vật liệu hydrogel. Khi cả 2 hệ CS-F127 và Alg-F127 mang RE; QU. Thời gian giảm cấp của chúng không thay đổi so với nền gel. Các hệ hydrogel Alg-F127 thời gian giảm cấp lâu hơn CS-F127. Nhưng ở các mốc khảo sát, có sự khác biệt về khối lượng giảm cấp của các hệ trước và sau khi mang thuốc. Xu hướng chung của cả hai nền
hydrogel là khối lượng giảm cấp của CS-F127 và Alg-F127 mang RE; QU ít hơn so với CS-F127 và Alg-F127, sự chênh lệch lớn trong khoảng từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 8 của thí nghiệm. Qua số liệu giảm cấp của hệ CS-F127 và Alg- F127 mang RE; QU ta thấy sau khi mang hoạt chất, khối lượng giảm cấp được cải thiện trong 8 ngày đầu. Khơng có sự suy yếu hệ gel, khơng có sự ảnh hưởng tiêu cực đến từ các hoạt chất chống oxi hóa lên độ bền của hệ hydrogel. Điều này mở ra ứng dụng lớn của hệ hydrogel trong ứng dụng mang hoạt chất chữa lành vết thương bệnh nhân đái tháo đường.
Hình 3.22. Đồ thị biểu diễn % khối lượng giảm cấp sinh học theo thời
gian của các mẫu hydrogel CS-F127/Alg-F127 mang hoạt chất RE (a), QU (b) trong môi trường PBS pH 7.4
Quan sát hình 3.21. So sánh thời gian giảm cấp của hệ hydrogel CS-F127 và Alg-F127 trước và sau khi mang 2 hoạt chất RE/QU trong hai môi trường sinh lý, môi trường PBS pH 7,4 cho thấy mẫu không mang hoạt chất giảm cấp nhanh hơn. Sau 12 ngày các mẫu đã giảm cấp hết. Môi trường DMEM thời gian giảm cấp dài hơn, sau 16 ngày khảo sát, mẫu hydrogel vẫn còn. Mẫu Alg-F127 mang hoạt chất thể hiện giảm cấp sinh học lâu hơn, sự mất mát khối lượng ít hơn so với mẫu Alg-F127 chưa mang hoạt chất cùng thời gian khảo sát. Ngược lại mẫu CS-F127 trước và sau khi mang hoạt chất có sự khác biệt giữa hai mơi trường sinh lý. Với PBS pH 7,4, mẫu CS-F127 sau khi mang hoạt chất có thời gian giảm cấp lâu hơn với hệ gel gốc 1,2 lần. Trong môi trường sinh lý DMEM mẫu CS-F127 mang 2 hoạt chất có thời gian giảm cấp là 16 ngày, trong khi đó mẫu CS-F127 vẫn cịn gần 40% khối lượng chưa giảm cấp. Điều này cho thấy
khả năng ứng dụng của các nền hydrogel Alg-F127 và CS-F127 mang hoạt chất trong ứng dụng chữa lành vết thương.
Hình 3.23. Đồ thị biểu diễn % khối lượng giảm cấp sinh học theo thời
3.4.5. Khảo sát và đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong hệ hydrogel
Trong thực nghiệm này, khoảng nhiệt độ tạo gel được xác định từ nhiệt độ tối thiểu tạo thành gel (Tgel) đến nhiệt độ gel bắt đầu bị chảy (Tm). Dựa trên kết quả ở khảo sát tổng quan về các Alg-F127 gel và CS-F127 gel, nhiệt độ khảo sát được bắt đầu từ 10 °C. Kết quả khảo sát được biểu diễn trong hình 3.24 và hình 3.25. Kết quả thu được từ quá trình khảo sát điểm tạo gel và tan gel theo nhiệt độ như trong hình 3.24 và hình 3.25. cho thấy giá trị Tgel và Tm của CS-F127 cùng Alg-F127 có sự phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường dùng để lưu mẫu polymer cũng như thời gian lưu. Nhưng sự phụ thuộc này tạo ra sự khác biệt khơng đáng kể. Qua hình theo dõi khả năng tạo gel của các hệ CS- F127 và Alg-F127 cho thấy sự ổn định của hệ theo thời gian. Hầu như khơng có sự khác biệt giữa khả năng tạo gel trước và sau khi lưu trữ. Sự ổn định này không thay đổi trong 2 tháng đầu. Nhiệt độ Tgel có sự biến đổi không đáng kể sau 6 tháng lưu trữ so với mẫu ban đầu trong môi trường 4 °C và 37 °C. Các mẫu hydrogel Alg-F127 chỉ khác nhau không đáng kể sau 6 tháng lưu trữ ở Tgel và Tm.Với Tgel khác biệt này lớn hơn trong môi trường lưu trữ 37 °C là 17,65- 28,57% (Alg-F127). Đối với Tm khoảng cách biệt này là 5,41-11,9% (Alg- F127) ở 4 nồng độ khảo sát lưu trữ trong môi trường 4 °C. Tương đồng với kết quả của Tgel, cách biệt Tm lớn hơn trong môi trường lưu trữ 37 °C, cụ thể là 8,11-16,67% (Alg-F127). Kết quả thay đổi nhẹ Tgel cho thấy hệ hydrogel khá ổn định trong lưu trữ.
Hình 3.24. Đồ thị thể hiện sự ổn định của các hydrogel Alg-F127 sau
lưu trữ 1 tháng (M1), 2 tháng (M2), 3 tháng (M3) và 6 tháng (M6) ở nhiệt độ bảo quản 4 °C (a) và 37°C (b)
Hình 3.25. Đồ thị thể hiện sự ổn định của các hydrogel CS-F127 sau lưu
trữ 1 tháng (M1), 2 tháng (M2), 3 tháng (M3) và 6 tháng (M6) ở nhiệt độ bảo quản 4 °C (a) và 37°C (b)
Kết quả thử nghiệm khả năng ổn định của hệ gel CS-F127 theo thời gian được thể hiện dưới hình 3.25. Có sự tương đồng kết quả giữa hai vật liệu hydrogel khảo sát, CS-F127 cũng có thời gian ổn định trong 2 tháng đầu, các thông số Tgel, Tm hầu như không thay đổi và có sự khác biệt khơng đáng kể sau 6 tháng lưu trữ. Giống với Alg-F127, thời gian bảo quả càng lâu thì các giá trị
20%) so với nồng độ hydrogel thấp hơn (14%, 16%). Các kết quả cho thấy khả năng ứng dụng của vật liệu CS-F127 làm vật liệu hydrogel trong tái tạo y sinh. Hình 3.26 thể hiện kết quả thử nghiệm sự ổn định của hoạt chất sau các mốc thời gian lưu trữ tại nhiệt độ 4 °C. Các hoạt chất sau thời gian lưu trữ đều có sự giảm nồng độ trong mẫu ít nhiều so với trước khi lưu.
Với những chất chống oxi hóa cao như QU và RE khả năng phân hủy diễn ra nhanh, có sự khác biệt đáng kể giữa hoạt chất trước và sau khi mang vào hệ chất mang [97], sự khác biệt thấy rõ ở hoạt chất RE Hình 3.26 a và QU Hình 3.26 b. Ngồi ra có sự khác nhau giữa hai môi trường lưu trữ ở hai hoạt chất này, với nhiệt 37 °C trên dưới 90% hoạt chất QU/RE đã bị phân hủy khi ở dạng tự do, kết quả tương đồng với các nghiên cứu công bố trước [98]. Nhưng điểm nổi bật được quan tâm ở đây là khi RE/QU được mang trong CS- F127/Alg-F127 chúng đã cải thiện độ ổn định của hoạt chất. Cụ thể trong môi trường 37°C, RE được mang bởi CS-F127 sau 1 tháng còn 85,05% và sau 6 tháng còn 51,21%, khi mang bởi Alg-F127 con số đó tương ứng là 87,85% và 53,51%. Các kết quả khảo sát độ ổn định của hoạt chất chống oxi hóa cho thấy tiềm năng lưu trữ bảo vệ hoạt chất theo thời gian và nhiệt độ môi trường. Ở điều kiện bảo vệ 4°C sự phân hủy RE/QU đã bị hạn chế so với nhiệt độ phòng, Với RE/QU tự do còn lại 46,05% (RE), 38,62%(QU) sau 6 tháng. Khi được mang trong hệ hydrogel phần trăm còn lại của chúng tương ứng là 79,49%, 87,28% (CS-F127) và 81,52%, 84,73% (Alg-F127) ( phụ lục 3 ). Giá trị này gấp 1,52-1,68 lần so với môi trường 37 ± 2°C. Từ các số liệu thu thập trong thí nghiệm độ ổn định hoạt chất, chúng ta nhận thấy nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến độ ổn định của hoạt chất chống oxi hóa (RE/QU) tự do cũng như nang hóa trong vật liệu hydrogel. Các hoạt chất được khuyến cáo lưu trữ trong điều kiện 4 ± 2°C nhằm tăng độ ổn định của hoạt chất theo thời gian bảo quản.
Hình 3.26. Độ ổn định của hoạt chất RE (a), QU (b) được đánh giá sau 6
tháng lưu trữ trong môi trường nước tại nhiệt độ phòng 37 ± 2°C và 4 ± 2°C khi mang bởi CS-F127/Alg-F127.
Điều này cho thấy sau khi được mang vào hệ hydrogel, không những không làm mất đi hoạt chất mà cịn tăng tính ổn định của chúng lên. Chứng tỏ tiềm năng lớn của hệ hydrogel trong việc mang các hoạt chất trong hỗ trợ điều trị.