CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3.2 Tiến hành thí nghiệm
Ở mỗi thí nghiệm, tiến hành thu mẫu thịt heo lặp lại là 3 lần.
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Phƣơng pháp thu và bảo quản mẫu
Thu mẫu: mẫu ở các sạp nhỏ lẻ được bỏ vào các bao nilon sạch, ở các siêu thị thì được bọc trong màng thực phẩm mỗi mẫu được đánh số và đem nhanh về phịng thí nghiệm, bảo đảm các mẫu khơng lây nhiễm với nhau khối lượng từ 100-200g
Bảo quản mẫu: hi mang về khơng phân tích ngay thì bỏ vào tủ lạnh bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC và thời gian không vượt quá 36 giờ
2.4.2 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu
Rã đơng trước khi phân tích: Phải rã đơng trong điều kiện vơ trùng nước khi phân tích mẫu.có thể rã đơng ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ hoặc 450
C trong Mẫu thịt heo xay nhuyễn
Thu mẫu
Đánh giá các chỉ tiêu
Chỉ tiêu cảm quan Chỉ tiêu Salmonella
Đánh giá kết quả Hình 2. 2 Bố trí thí nghiệm
40 vịng 15 phút.
Cân mẫu: Cân một lượng mẫu xác định tùy theo từng chỉ tiêu yêu cầu như trên, cân chính xác một lượng mẫu nhất định. Sai số cho phép cân này là ±0.1g lượng mẫu phân tích cho vào các bình chứa bằng nhựa hoăc nylon vô trùng. Trong đề tài này khối lượng là 25g.
Đồng nhất mẫu: Sau khi đã cân mẫu và cho dung dịch pha loãng vào mẫu, tiến hành đồng nhất mẫu để đảm bảo sự phân phối của vi sinh vật vào dung dịch pha loãng thật đồng đều.
2.4.3 Phƣơng pháp phân tích định tính Salmonella
Đánh giá sự hiện diện của Salmonella trong mẫu thịt heo xay nhuyễn
2.4.3.1 Nguyên tắc
Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong một lượng mẫu xác định.
Tăng sinh các vi sinh vật có trong mẫu bằng BPW và cấy mẫu đã tăng sinh vào môi trường tăng sinh chọn lọc RVS, phân lập trên môi trường XLD và khẳng định bằng test sinh hóa hố (mơi trường TSI, Urea broth, lên men Mannitol, LDC broth, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer).
41
2.4.3.2 Quy trình phân tích
25g Thịt heo xay nhuyễn 225ml BPW
ở 370C trong 24 giờ
Hút 0,1ml mẫu tăng sinh cho vào ống nghiệm 10ml môi trường RVS
ở nhiệt độ 420C ở 24 giờ Cấy chuyển sang môi trường đ a XLD
ở 370C ở 24 giờ
huẩn lạc đạc trưng Salmonella: trịn, lịi, trong suốt có tâm đen, xung quanh chuyển sang màu hồng.
Các thí nghiệm sinh hóa: TSI; LDC; Urea ; Manitol; Indole; VP ết luận mẫu Tiền Tăng Sinh Tăng Sinh Chọn Lọc Phân Lập hẳng Định
42
2.4.3.3 Thuyết minh quy trình
Tiền tăng sinh
Cân 25g mẫu thịt heo xay nhuyễn cho vào túi nylon vô trùng rồi cho vào 225ml môi trường BPW đồng nhất mẫu. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 0,1ml dịch mẫu tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS . Đem ủ ở nhiệt độ 420C trong 24 giờ .
Phân lập
Dùng que cấy vịng lấy sinh khối VSV từ mơi trường tăng sinh chọn lọc RVS, cấy ria lên môi trường XLD, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường XLD có đặc điểm: Trịn, lịi, trong suốt có hay khơng có tâm đen, một số dịng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.
Thí nghiệm khẳng định:
huẩn lạc nghi ngờ Salmonell a được kiểm tra sinh hóa: Hình 2. 4 Khuẩn lạc Salmonella
43 Môi trường TSI:
Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn cacbonhydrate có mặt trong mơi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas trong môi trường.
Cơ sở sinh hóa
Mơi trường TSI là mơi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa. Mơi trường TSI có các nguồn carbohydrate: lactose 1%, glucose 0,1% và sucrose 1%.
Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường TSI: chỉ lên men glucose, lên men cả glucose lẫn lactose và không lên men được cả 2 nguồn cacbonhydrate này
Nếu vi sinh vật lên men được glucose sau 18-24 giờ nuôi cấy: phần nghiêng của môi trường pH có kiềm và phần sâu có pH acid. Hiện tượng này được quan sát khi có chất chỉ thị pH trong môi trường và chất chỉ thị pH thường được sử dụng là phenol red. Điều này có ngh a là trên phần nghiêng, một lượng nhỏ glucose được sử dụng hết hồn tồn, sau đó chúng sử dụng đến pepton làm giải phóng NH3→pH kiềm→phần nghiêng có màu đỏ. Trong khi đó, ở phần sâu có sự lên men kỵ khí glucose→các acid hữu cơ→pH acid→phần sâu có màu vàng.
Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả hai nguồn carbohydrate: Cả phần sâu lẫn phần nghiêng đều có tính acid sau 18-24 giờ nuôi cấy→cả phần nghiêng lẫn phần sâu đề có màu vàng vì lượng đường lactose đủ để vi sinh vật sử dụng trong thời gian này.
Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả 2 nguồn cabonhydrate trên: khi đó nguồn peptone trở thành nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật→làm mơi trường có màu đỏ.
44
ni cấy. Cịn trường hợp có sinh gas thì sẽ tích tụ trong mơi trường và có thể làm v thạch hay tạo thành các bọt khí bên trong.
Cách tiến hành
Môi trường TSI được chuẩn bị trong các ống nghiệm với phần nghiêng cách nắp ống khoảng 2,5 cm, phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm. Dùng que cấy thẳng đưa vi sinh vật vào phần sâu của ống nhưng không đụng đáy ống, sau đó cấy ria lên phần nghiêng. các ống nghiệm đã cấy ở 300C trong 18-24 giờ. Ghi lại các biểu hiện ở phần sâu, phần nghiêng, sinh H2S và sinh gas.
Hình 2. 5 Mơi trường TSI Thử nghiệm LDC Thử nghiệm LDC
Nguyên tắc: Nhằm xem VSV có tiết enzyme Lysine decacboxylase hay khơng
Cơ sở sinh hóa
hi cấy VSV lên men đường dextrose vào mơi trường LDC thì một lượng axit sẽ được sinh ra do quá trình lên men dẫn đến làm thay đổi màu sắc của mơi trường (tím vàng) do có chất Bromocresol purple làm chỉ thị. Sau khi nuôi cấy Salmonella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu
45
Thử nghiệm ( ): mơi trường giữ ngun màu tím ban đầu canh khuẩn đục, mơi trường bị kiềm hóa
Thử nghiệm (-): mơi trường có màu vàng
Thử nghiệm Urea Broth
Nguyên tắc: Xác định VSV có khả năng phân hủy urea thành ammonia và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi sinh vật tiết ra.
Cơ sở sinh hóa: Urea là một hợp chất carbamide rất dễ bị thủy giải. Sự thủy giải của urea bởi sự xúc tác của urease sẽ giải phóng 2 phân tử ammonia. Trong dung dịch các thành phần sau phản ứng sẽ chuyển hóa thuận nghịch, sản phẩm thu được sau phản ứng, sản phẩm thu được sẽ biểu diễn qua phản ứng sau:
Urea + H2O CO2 + H2O + NH3 ammonia carbonat
Enzyme urease là một enzyme quan trọng trong tế bào VSV. hi có cơ chất ure hiện diện trong môi trường, enzyme này được tổng hợp và phóng thích ra bên ngồi tế bào, xúc tác phản ứng thủy giải urea. Các sản phẩm sau phản ứng làm mơi trường hóa kiềm và chuyển màu chất chỉ thị pH
Cách tiến hành
46
Cấy VSV vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là phenol red, ủ ở nhiệt độ trong khoảng 12-18 giờ.
Đọc kết quả
Thử nghiệm ( ): môi trường chuyển sang màu vàng Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu
Lên men Mannitol
Nguyên tắc: Xác định VSV có lên men Mannitol tạo sự sinh hơi và sinh acid.
Cơ sở sinh hóa
Mơi trường phenol red both base pH 7,4 chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển sang màu vàng khi pH<6,8. hả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi
Cách tiến hành và đọc kết quả
Cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định ủ ở 37oC trong 18-24 giờ . Sinh acid ( ): môi trường màu cam chuyển sang màu vàng do bị acid hóa. Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống nghiệm
47
Hình 2. 8 Lên men Manitol Thử nghiệm Indole Thử nghiệm Indole
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi khuẩn có thể tạo indol trong mơi trường trypton
Cơ sở sinh hóa:
Tryptophan là một aminoacid có thể bi oxi hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo nên các hợp chất indol hay các dẫn xuất của chúng như: indol, skatol (methyl indol) và indolacetic. Một số enzyme nội bào được gọi chung là tryptophanase tham gia trong quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động giải phóng trytophane. Các hợp chất trung gian trong q trình thủy giải trytophan là acid indolepyruvic, từ đó indol được tạo thành trong quá trình khử amin, hình thành skatol là quá trình khử carboxyl acid indol acetic.
Sự tách amin từ tryptophane là một dạng phản ứng khử . Qua quá trình này nhóm amin được tách ra và chuyển thành NH3 , quá trình khử giải phóng một phần năng lượng được sử dụng cho hoạt động tăng trưởng của vi sinh vật . Đồng thời quá trình này cịn tạo thành acid pyruvic, cơ chất tham gia vào chu trình Krebs để tiếp tục thu năng lượng . Phát hiện indol và các dẫn xuất của chúng trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử ovac's hay Ehrlich's.
48
cấy là p dimethylaminobenzaldehyde( DMAB ). Chất này phản ứng với indol tạo thành một phức hợp màu đỏ. Phản ứng này là do nhân pyrrol của indol phản ứng với nhóm aldehyde của DMAB qua hai giai đoạn để tạo thành nhân quinone có màu đỏ , phản ứng như sau.
Cách tiến hành và đọc kết quả:
Cấy vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường cạnh trypton khoản 24 - 48 giờ . Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên bề mặt một trường , thêm vài giọt thuốc thử ovac's hay Erhlich . Quan sát sau vài phút , phản ứng dương tính nếu trên bề mặt mơi trường có vịng màu đó xuất hiện . Ngược lại nếu khơng có sự xuất hiện của màu đỏ hồng được coi là phản ứng âm tính.
Hình 2. 9 Thử nghiệm Indole Thử nghiệm Voges- Proskauer Thử nghiệm Voges- Proskauer
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol (acetoin) trong q trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hóa
Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong q trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể
49
chia vi sinh vật thành 2 nhóm theo 2 con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau nhu sau: nhóm trao đổi khơng tạo thành 2,3-butanediol như E.Coli là nhóm VP (-) và
nhóm trao đổi tạo thành 2,3-butanediol, như Klebsiella là nhóm VP (+). Tuy nhiên, phản ứng VP nhằm mục đích phát hiện acetoin là một tiền chất của 2,3-butanediol. Vì acetoin là tiền chất của 2,3-butanediol nên trong quá trình ni cấy tích lũy rất ít. Để dễ dàng cho q trình phát hiện, vi dinh vật phải được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí.
Để phát hiện acetoin trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, α- naphtol được sử dụng như một thuốc thử hát hiện môi trường kiềm mạnh được tạo ra OH 40% được cho vào môi trường thử nghiệm.
Cách tiến hành
Cấy vi sinh vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt độ 300
C trong 2-5 ngày. Thêm vào canh khuẩn dịch thuốc thử α- naphtol 5% trong cồn và dung dịch OH 40% với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.
Đọc kết quả
Thử nghiệm ( ): xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu.
50
Hình 2. 10 Thử nghiệm Voges-Prokauer
2.4.3.4 Nhận định tính chất hóa sinh đặc hiệu
Tính chất hóa sinh đặc hiệu được mô tả ở bảng 2.1 Bảng 2. 1 Tính chất hóa sinh đặc hiệu Tính chất sinh hố Dương hoặc âm
tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella TSI lactose - 99,2 TSI sucrose - 99,5 TSI glucose + 100
TSI glucose sinh hơi + 91,2
TSI hydro-sulfua + 91,6
Phân giải urê - 100,0
Lên men mannitol +
Phản ứng Indol - 98,2
Phản ứng V.P - 100,0
51
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả đánh giá cảm quan thịt
Qua những lần thử nghiệm, đánh giá cảm quan và các chỉ tiêu vi sinh vật thịt tươi sau đây là bảng đánh giá về trạng thái, màu sắc, mùi vị được mô tả ở bảng 3.1
Bảng 3. 1 Đánh giá cảm quan về các mẫu thịt tươi
STT Mẫu thịt Trạng thái Màu sắc Mùi vị
1 1 hông sạch, không tạp chất, có nước thịt Thịt đỏ tươi, hơi trắng ngà Mùi đặc trưng 2 2 hông sạch, không lẫn tạp chất Thịt đỏ tươi, m màu trắng Mùi đặc trưng 3 3 hơng sạch, có vụn xương, Thịt hồng nhạt, m trắng ngà Mùi đặc trưng 4 4 Khơng sạch,khơng có tạp chất, có nước thịt Thịt hồng, m hơi trắng ngà Mùi đặc trưng 5 5 hông sạch, không tạp chất Thịt đỏ, m trắng Mùi đặc trưng 6 6 hơng sạch, có vụn xương, Thịt đỏ thẩm, m màu trắng Mùi đặc trưng 7 7 hơng sạch, ít xương, có lơng Thịt hồng nhạt, m trắng đục Mùi đặc trưng 8 8 hông sạch, không tạp chất Thịt đỏ tươi, m trắng ngà Mùi đặc trưng 9 9 hơng sạch, có xương vụn Thịt hồng đậm, m màu trắng Mùi đặc trưng 10 10 hông sạch, không tạp chất Thịt hồng, có m trắng ngà Mùi đặc trưng 11 SaTraFood Sạch, không tạp chất Thịt hồng nhạt, m màu
trắng
Mùi đặc trưng 12 VinMart Sạch, không tạp chất Thịt hồng , m màu
trắng
52 Stt Mẫu thịt Hình Stt Mẫu thịt Hình 1 1 7 7 2 2 8 8 3 3 9 9 4 4 10 10 5 5 11 VinMart 6 6 12 SaTra Food Hình 3. 1 Các mẫu thịt ở sạp và siêu thị
53
Dựa vào kết quả cảm quan các mẫu thịt trình bày trên bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng :
Về màu sắc: Các mẫu của từng sạp có màu sắc đặc trưng là từ màu hồng nhạt đến màu đỏ thẩm của thịt. Tuy nhiên trong có một mẫu của sạp 6 thì thịt có màu đỏ đậm khác thường, sáng và bóng hơn sự các sạp cịn lại bởi vì đó có thể là thịt lợn siêu nạt do thịt đã nhiễm chất tăng trọng hay do để lâu bên ngoài ở nhiệt độ thường thịt bị đổi màu đậm hơi. Còn đối với các mẫu thịt thu tại VinMart và SaTraFood, màu sắc này đỏ tươi hơn so với các mẫu thịt tại chợ.
Về mùi: Các mẫu thịt thu tại 12 sạp có mùi đặc trưng của thịt, khơng có mùi lạ, khơng có mùi ơi thiu
Về trạng thái của mẫu:
Thịt ở các sạp nhỏ lẻ bề mặt ngồi hơi ướt, có nước nhưng khơng nhớt, khơng được sạch, có dính lơng và lẫn xương vụn có độ dính và độ đàn hồi của thịt. Bên cạnh đó, do khơng khí ở những quầy thịt đó thiếu sự thống mát, lưu lượng người vào chợ tương đối đông làm nguy cơ lây nhiễm chéo từ quầy này sang quầy khác rất dễ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ bình thường. Ngồi ra thì thời gian lựa thịt của các sạp thì rất khác nhau, và dụng cụ giết mổ thì khơng được sạch sẽ so với siêu thị.
Đối với mẫu thịt thu tại siêu thị SaTraFood và VinMart: bề mặt sạch, khô không nhớt, không lẫn tạp chất, có độ dính và độ đàn hồi của thịt do được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C và được bao bằng màng thực phẩm nên có độ tin cậy hơn, chất lượng hơn, giá thành ổn định hơn .
Tóm lại, theo TCVN 7046:2002 các mẫu thịt heo khi tiến hành thu mẫu ở trong khu vực chợ Bình Tây vẫn trong tình trạng tốt về màu sắc, mùi vị và trạng thái khơng có sự biểu hiện của sự hư hỏng, ơi thiu sau khi được vận chuyển từ nơi