CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.3.3 Thuyết minh quy trình
Tiền tăng sinh
Cân 25g mẫu thịt heo xay nhuyễn cho vào túi nylon vô trùng rồi cho vào 225ml môi trường BPW đồng nhất mẫu. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 0,1ml dịch mẫu tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS . Đem ủ ở nhiệt độ 420C trong 24 giờ .
Phân lập
Dùng que cấy vịng lấy sinh khối VSV từ mơi trường tăng sinh chọn lọc RVS, cấy ria lên môi trường XLD, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường XLD có đặc điểm: Trịn, lịi, trong suốt có hay khơng có tâm đen, một số dịng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.
Thí nghiệm khẳng định:
huẩn lạc nghi ngờ Salmonell a được kiểm tra sinh hóa: Hình 2. 4 Khuẩn lạc Salmonella
43 Mơi trường TSI:
Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn cacbonhydrate có mặt trong mơi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas trong mơi trường.
Cơ sở sinh hóa
Môi trường TSI là môi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa. Mơi trường TSI có các nguồn carbohydrate: lactose 1%, glucose 0,1% và sucrose 1%.
Có 3 trường hợp xảy ra khi ni cấy vi sinh vật trên môi trường TSI: chỉ lên men glucose, lên men cả glucose lẫn lactose và không lên men được cả 2 nguồn cacbonhydrate này
Nếu vi sinh vật lên men được glucose sau 18-24 giờ nuôi cấy: phần nghiêng của mơi trường pH có kiềm và phần sâu có pH acid. Hiện tượng này được quan sát khi có chất chỉ thị pH trong môi trường và chất chỉ thị pH thường được sử dụng là phenol red. Điều này có ngh a là trên phần nghiêng, một lượng nhỏ glucose được sử dụng hết hoàn tồn, sau đó chúng sử dụng đến pepton làm giải phóng NH3→pH kiềm→phần nghiêng có màu đỏ. Trong khi đó, ở phần sâu có sự lên men kỵ khí glucose→các acid hữu cơ→pH acid→phần sâu có màu vàng.
Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả hai nguồn carbohydrate: Cả phần sâu lẫn phần nghiêng đều có tính acid sau 18-24 giờ nuôi cấy→cả phần nghiêng lẫn phần sâu đề có màu vàng vì lượng đường lactose đủ để vi sinh vật sử dụng trong thời gian này.
Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả 2 nguồn cabonhydrate trên: khi đó nguồn peptone trở thành nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật→làm mơi trường có màu đỏ.
44
ni cấy. Cịn trường hợp có sinh gas thì sẽ tích tụ trong mơi trường và có thể làm v thạch hay tạo thành các bọt khí bên trong.
Cách tiến hành
Môi trường TSI được chuẩn bị trong các ống nghiệm với phần nghiêng cách nắp ống khoảng 2,5 cm, phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm. Dùng que cấy thẳng đưa vi sinh vật vào phần sâu của ống nhưng không đụng đáy ống, sau đó cấy ria lên phần nghiêng. các ống nghiệm đã cấy ở 300C trong 18-24 giờ. Ghi lại các biểu hiện ở phần sâu, phần nghiêng, sinh H2S và sinh gas.
Hình 2. 5 Mơi trường TSI Thử nghiệm LDC Thử nghiệm LDC
Nguyên tắc: Nhằm xem VSV có tiết enzyme Lysine decacboxylase hay khơng
Cơ sở sinh hóa
hi cấy VSV lên men đường dextrose vào mơi trường LDC thì một lượng axit sẽ được sinh ra do quá trình lên men dẫn đến làm thay đổi màu sắc của mơi trường (tím vàng) do có chất Bromocresol purple làm chỉ thị. Sau khi nuôi cấy Salmonella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu
45
Thử nghiệm ( ): mơi trường giữ nguyên màu tím ban đầu canh khuẩn đục, mơi trường bị kiềm hóa
Thử nghiệm (-): mơi trường có màu vàng
Thử nghiệm Urea Broth
Nguyên tắc: Xác định VSV có khả năng phân hủy urea thành ammonia và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi sinh vật tiết ra.
Cơ sở sinh hóa: Urea là một hợp chất carbamide rất dễ bị thủy giải. Sự thủy giải của urea bởi sự xúc tác của urease sẽ giải phóng 2 phân tử ammonia. Trong dung dịch các thành phần sau phản ứng sẽ chuyển hóa thuận nghịch, sản phẩm thu được sau phản ứng, sản phẩm thu được sẽ biểu diễn qua phản ứng sau:
Urea + H2O CO2 + H2O + NH3 ammonia carbonat
Enzyme urease là một enzyme quan trọng trong tế bào VSV. hi có cơ chất ure hiện diện trong mơi trường, enzyme này được tổng hợp và phóng thích ra bên ngồi tế bào, xúc tác phản ứng thủy giải urea. Các sản phẩm sau phản ứng làm mơi trường hóa kiềm và chuyển màu chất chỉ thị pH
Cách tiến hành
46
Cấy VSV vào mơi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là phenol red, ủ ở nhiệt độ trong khoảng 12-18 giờ.
Đọc kết quả
Thử nghiệm ( ): môi trường chuyển sang màu vàng Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu
Lên men Mannitol
Nguyên tắc: Xác định VSV có lên men Mannitol tạo sự sinh hơi và sinh acid.
Cơ sở sinh hóa
Mơi trường phenol red both base pH 7,4 chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển sang màu vàng khi pH<6,8. hả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi
Cách tiến hành và đọc kết quả
Cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định ủ ở 37oC trong 18-24 giờ . Sinh acid ( ): môi trường màu cam chuyển sang màu vàng do bị acid hóa. Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống nghiệm
47
Hình 2. 8 Lên men Manitol Thử nghiệm Indole Thử nghiệm Indole
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi khuẩn có thể tạo indol trong mơi trường trypton
Cơ sở sinh hóa:
Tryptophan là một aminoacid có thể bi oxi hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo nên các hợp chất indol hay các dẫn xuất của chúng như: indol, skatol (methyl indol) và indolacetic. Một số enzyme nội bào được gọi chung là tryptophanase tham gia trong quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động giải phóng trytophane. Các hợp chất trung gian trong q trình thủy giải trytophan là acid indolepyruvic, từ đó indol được tạo thành trong quá trình khử amin, hình thành skatol là quá trình khử carboxyl acid indol acetic.
Sự tách amin từ tryptophane là một dạng phản ứng khử . Qua q trình này nhóm amin được tách ra và chuyển thành NH3 , quá trình khử giải phóng một phần năng lượng được sử dụng cho hoạt động tăng trưởng của vi sinh vật . Đồng thời quá trình này cịn tạo thành acid pyruvic, cơ chất tham gia vào chu trình Krebs để tiếp tục thu năng lượng . Phát hiện indol và các dẫn xuất của chúng trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử ovac's hay Ehrlich's.
48
cấy là p dimethylaminobenzaldehyde( DMAB ). Chất này phản ứng với indol tạo thành một phức hợp màu đỏ. Phản ứng này là do nhân pyrrol của indol phản ứng với nhóm aldehyde của DMAB qua hai giai đoạn để tạo thành nhân quinone có màu đỏ , phản ứng như sau.
Cách tiến hành và đọc kết quả:
Cấy vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường cạnh trypton khoản 24 - 48 giờ . Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên bề mặt một trường , thêm vài giọt thuốc thử ovac's hay Erhlich . Quan sát sau vài phút , phản ứng dương tính nếu trên bề mặt mơi trường có vịng màu đó xuất hiện . Ngược lại nếu khơng có sự xuất hiện của màu đỏ hồng được coi là phản ứng âm tính.
Hình 2. 9 Thử nghiệm Indole Thử nghiệm Voges- Proskauer Thử nghiệm Voges- Proskauer
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol (acetoin) trong q trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hóa
Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong q trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể
49
chia vi sinh vật thành 2 nhóm theo 2 con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau nhu sau: nhóm trao đổi khơng tạo thành 2,3-butanediol như E.Coli là nhóm VP (-) và
nhóm trao đổi tạo thành 2,3-butanediol, như Klebsiella là nhóm VP (+). Tuy nhiên, phản ứng VP nhằm mục đích phát hiện acetoin là một tiền chất của 2,3-butanediol. Vì acetoin là tiền chất của 2,3-butanediol nên trong q trình ni cấy tích lũy rất ít. Để dễ dàng cho quá trình phát hiện, vi dinh vật phải được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí.
Để phát hiện acetoin trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, α- naphtol được sử dụng như một thuốc thử hát hiện môi trường kiềm mạnh được tạo ra OH 40% được cho vào môi trường thử nghiệm.
Cách tiến hành
Cấy vi sinh vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt độ 300
C trong 2-5 ngày. Thêm vào canh khuẩn dịch thuốc thử α- naphtol 5% trong cồn và dung dịch OH 40% với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.
Đọc kết quả
Thử nghiệm ( ): xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường Thử nghiệm (-): mơi trường khơng đổi màu.
50
Hình 2. 10 Thử nghiệm Voges-Prokauer